史云芳，張穎

單基因遺傳病是由1個或1對等位基因突變引起的疾病，符合孟德爾遺傳規(guī)律。雖然每種單基因病的發(fā)病率較低，但因其種類較多，總體患病率并不低。據(jù)統(tǒng)計，每1 000個活產(chǎn)兒中就有40～82人患有單基因遺傳?。?］。截止到2018年6月11日，已明確發(fā)病機制的單基因遺傳病有5 262種（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/）。目前多數(shù)單基因遺傳病尚無有效的治療方法，致死、致畸和致殘率高，給家庭和社會造成了巨大負擔，因此避免此類患兒出生尤為重要。

傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方法是通過絨毛膜取樣或羊膜腔穿刺獲得胎兒樣本后進行產(chǎn)前診斷。該方法對于孕婦及胎兒是創(chuàng)傷性的，有流產(chǎn)、死胎等風險［2-3］。妊娠婦女血漿中胎兒游離DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）的發(fā)現(xiàn)［4］使無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（non-invasive prenatal testing，NIPT）篩查胎兒染色體非整倍體成為可能，并已廣泛用于胎兒常見染色體非整倍體的篩查。隨著研究的不斷深入，利用cffDNA進行無創(chuàng)產(chǎn)前診斷（non-invasive prenatal diagnosis，NIPD）單基因遺傳病的研究也取得一些成果。本文主要對NIPD的研究進展及其面臨的挑戰(zhàn)做一綜述。

1 NIPD常用的技術(shù)方法

目前無創(chuàng)產(chǎn)前診斷單基因遺傳病的主要技術(shù)包括：（1）PCR技術(shù)，如實時PCR（Real-time PCR）、限制性內(nèi)切酶PCR（PCR with restriction enzyme digest，PCR-RED）和微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）等。（2）環(huán)化單分子擴增和重測序技術(shù)（circulating single - molecule amplication and resequencing technology，cSMART）。（3）第二代測序（next-generation sequencing，NGS）等［5］。

1.1 PCR技術(shù)

1.1.1 Real-time PCR Real-time PCR是通過擴增胎兒通用序列，如Y染色體序列以確定胎兒性別或RHD基因確定胎兒RH血型，來診斷單基因遺傳病，而不是直接檢測基因突變，比如僅在男胎中確診杜氏肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD），或僅在女胎中確診先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥（congenital adrenal hyperplasia，CAH），這樣避免了大約50%的有創(chuàng)產(chǎn)前診斷。在英國等國家和地區(qū)，通過cffDNA檢測Y染色體已經(jīng)成為嚴重性連鎖遺傳病標準產(chǎn)前服務(wù)的一部分，2011年英國遺傳監(jiān)測網(wǎng)批準3個實驗室開展該技術(shù)用于無創(chuàng)產(chǎn)前診斷［5］。

1.1.2 PCR-RED 早期一些NIPD是應(yīng)用PCRRED檢測基因突變，如與軟骨發(fā)育不全、致死性軟骨發(fā)育不良相關(guān)的FGFR3基因突變［6］，其原理是應(yīng)用限制性內(nèi)切酶切斷包含突變位點的DNA序列，再通過瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。該方法準確，快速，費用相對低，但評價結(jié)果主觀性強，大約7%～8%無肯定結(jié)論，也不適用所有突變［5-6］。除此之外，該方法1次僅能發(fā)現(xiàn)1個突變，適合檢測已知突變。在超聲結(jié)果提示胎兒異?；蛲蛔兾粗?，尤其是多種突變引起的異常時，該方法并不適用。盡管存在這些限制，英國國民健康服務(wù)（National Health Service,NHS）于2013年仍將該技術(shù)用于無創(chuàng)產(chǎn)前診斷［2］。

1.1.3 ddPCR ddPCR是一種新型的、可對DNA或RNA進行絕對定量的檢測技術(shù)，每個微滴作為一個獨立的PCR反應(yīng)，擴增后利用探針上的特異性熒光信號對每個微滴進行檢測，最后根據(jù)泊松分布原理，計算出原始樣本的濃度。該方法與Real-time PCR不同，不依靠擴增曲線進行定量，不受擴增效率影響，也不依賴復(fù)雜的生物信息學分析，在痕量樣本檢測等方面具有明顯優(yōu)勢［7］。Camunas-Soler等［8］應(yīng)用ddPCR技術(shù)成功無創(chuàng)產(chǎn)前診斷了9例單基因遺傳病，包括血友病、鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶缺陷癥、囊性纖維化、β-地中海貧血、甲羥戊酸激酶缺乏癥、乙酰膽堿受體缺陷癥和常染色體隱性遺傳非綜合征型耳聾，在孕11周時即可做出診斷，cffDNA比例最低僅為3.7%。Gruber等［9］應(yīng)用該技術(shù)檢測4對神經(jīng)纖維瘤NF1突變基因和4對囊性纖維化CFTR突變基因的夫婦，研究結(jié)果顯示所有母體血漿樣本中都正確地確定了父源性突變基因的存在與否。該技術(shù)也被用在血友病F8和F9基因突變［10］和甲基丙二酸血癥MUT基因突變［11］的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷中。

雖然ddPCR在無創(chuàng)產(chǎn)前診斷中具有較高的敏感度和特異度，但需要針對不同家系的突變設(shè)計相應(yīng)的探針，不能對所有家系設(shè)計通用的檢測體系，而且cffDNA片段較短，在探針和引物設(shè)計方面難度較大。

1.2 cSMART cSMART技術(shù)是一種對血漿中游離DNA低比例突變進行定性和絕對定量的新型檢測技術(shù)，可以消除潛在的PCR擴增偏倚，精確量化原始血漿樣本中突變等位基因的比例［12］。該方法已經(jīng)用于無創(chuàng)胎兒單基因遺傳病的檢測、腫瘤靶向用藥及療效動態(tài)監(jiān)測。Lv等［12］首先應(yīng)用該技術(shù)對4個威爾遜?。╓ilson disease，WD）家族的ATP7B基因突變進行了無創(chuàng)產(chǎn)前診斷，結(jié)果與有創(chuàng)產(chǎn)前診斷結(jié)果一致。因為該方法只需知道父母的致病性突變，使其有望成為各種單基因遺傳病NIPD的通用策略。Han等［13］也應(yīng)用該方法對 80個攜帶GJB2或SLC26A4基因突變的常染色體隱性遺傳性非綜合征型耳聾家系進行無創(chuàng)產(chǎn)前診斷，與傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷方法相比，91.3%的胎兒得到正確診斷，有5例樣本由于cffDNA比例低（＜6%），與傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷結(jié)果不一致；如果cffDNA比例＞6%，則該方法的敏感度和特異度達到100%和96.5%。此外苯丙酮尿癥中PAH基因突變［14］也可用該方法進行檢測。

1.3 NGS NGS的出現(xiàn)，尤其是臺式測序儀的出現(xiàn)，使NIPD的范圍逐漸擴大，從定向擴增選定基因中含有多個已知突變［6,15］，到遺傳分析更為復(fù)雜的隱性遺傳病［16］、X連鎖遺傳病［17］和母源性顯性遺傳病。和PCR-RED技術(shù)相比，該方法可以同時分析FGFR3基因的29個已知致病突變［6］，顯著提高了檢測覆蓋度和敏感度，在2014年被NHS準入臨床應(yīng)用［2］。該方法已有廣泛的驗證，而檢測流程僅需5 d［2,6］。

2 無創(chuàng)產(chǎn)前診斷策略

NIPD最直接的方法是在母血中檢測出異常突變，已經(jīng)從最初的識別父源性遺傳的變異發(fā)展到用于更復(fù)雜的基因突變。

本試驗考察了不同提取方式、不同提取時間以及不同提取溶劑下的樣品色譜圖，對比各條件下的譜圖的分離情況確定供試品溶液制備條件，具體條件見“2.3”項下。

2.1 父源性常染色體顯性遺傳病以及新發(fā)突變 NIPD用于臨床首先是針對父源性常染色體顯性遺傳病，即排除或識別父源性變異和檢測出新發(fā)變異。在這種情況下，技術(shù)方法簡單直接，因為導致突變的父源性基因并不存在于母體內(nèi)，通過檢測母體血漿中父源性等位基因的存在與否即可對胎兒進行診斷。隱性遺傳病中父源性突變的缺失將提示胎兒為攜帶者或正常。2002年Gonzales-Gonzalez等［18］利用PCR和限制性內(nèi)切酶分析在母體血漿中發(fā)現(xiàn)了一種父源性遺傳的引起囊性纖維化的突變。然而，母體DNA的高背景意味著只能檢測到父源性突變，無法評估胎兒是否也攜帶母體突變的可能性，這就需要通過有創(chuàng)產(chǎn)前診斷來確定母親等位基因的遺傳。

2.2 常染色體隱性遺傳病和X連鎖遺傳病 對于常染色體隱性遺傳病和X連鎖遺傳病，需要確定是否有母源性突變基因的遺傳。這一技術(shù)難度較高，因為母體血漿中DNA主要來源于母親，背景高，NIPD時需要評價突變基因和野生型基因的相對數(shù)量。為了提高敏感度，目前常用的2種分析方法是相對突變劑量（relative mutation dosage，RMD）和相對單倍型劑量（relative haplotype dosage，RHDO）。

2.2.1 RMD RMD方法是根據(jù)母體血漿中突變等位基因和野生型等位基因的比例來推斷確定胎兒基因型。如果為純合子患兒，該比值會升高；如果胎兒和母親基因型相同，即為攜帶者，該比值相等；如果胎兒為野生型純合子，該比值降低［2,5］。Perlado等［19］使用RMD結(jié)合ddPCR方法計算母體血漿中cffDNA的比例，通過檢查不同等位基因并計算其是否平衡來無創(chuàng)診斷母源性遺傳的單基因遺傳病。如果母體和胎兒基因型之間等位基因平衡，通過檢測SRY序列（用于妊娠男胎）或通用標記RASSF1A（胎兒超甲基化，母親去甲基化）來確認胎兒DNA的存在（用于妊娠女胎）［2］。該方法敏感度、特異度高，可以檢測單核苷酸多態(tài)性（SNPs）位點和微小缺失，操作流程相對簡單，但只適合檢測1個已知突變，而且需要根據(jù)不同突變設(shè)計不同探針，不能檢測大的結(jié)構(gòu)變異和有相似序列的突變。

2.2.2 RHDO RHDO方法是通過比較母體血漿中突變基因和野生型等位基因周圍SNP位點的相對量來推斷胎兒單倍型。該方法將RMD方法和連鎖分析結(jié)合起來，通過對一系列SNPs進行測序來實現(xiàn)單倍型分析。分析中包含的SNP數(shù)量越多，統(tǒng)計能力越強［2,5］。Parks等［17］設(shè)計靶向NGS捕獲測序突變基因周圍的高雜合度SNPs，構(gòu)建單倍型，然后使用先證者的SNPs推斷受影響的單倍型并分類母體SNPs，計算母體血漿中各單倍型的低表達或過表達，從而無創(chuàng)產(chǎn)前診斷DMD和貝氏肌營養(yǎng)不良（Becker muscular dystrophy，BMD）。 研 究 發(fā) 現(xiàn)RHDO在精確定位重組位點上是有效的，同時顯示母體血漿中胎兒比例＞4%的情況下，該方法的準確度達到100%。RHDO也被用于分析CAH［20］和脊肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）［16］，這兩種疾病的致病基因由于存在高度同源性的假基因，設(shè)計特異性檢測較為困難，無法直接進行突變分析。RHDO的主要優(yōu)點是分析不受突變類型的限制，適用于有假基因、大的基因缺失和致病突變位于重復(fù)區(qū)域的情況［20］，檢測效率高，可以一次發(fā)現(xiàn)多個突變。目前其已被用于囊性纖維化的確診，并用于臨床［2,21］。RHDO方法也有一定的局限性［5］，其一是近親結(jié)婚妊娠時，由于缺少有信息的SNPs，無法推斷單倍型；其二是需要受累親屬的DNA做單倍型分類，如果沒有先證者樣本，檢測將無法進行。

最近10×Genomics公司的linked-read測序技術(shù)解決了沒有先證者而無法進行無創(chuàng)產(chǎn)前診斷這一難題。Hui等［22］直接分析父母單倍型，將父親、母親的完整DNA序列包裹到凝膠珠上，使DNA被片段化，并用條形碼標記；經(jīng)過測序后，基于條形碼將DNA分子重新組裝成單倍型；分析父母單倍型并確定致病基因位點附近的SNP后，用RHDO方法分析母體血漿DNA的測序數(shù)據(jù)，推測胎兒的突變狀態(tài)。該方法只需要分析父母的單倍型，無需先證者樣本，使其在臨床上更為實用。

Vermeulen等［23］在NIPD中采用靶向位點擴增（targeted locus amplication,TLA）技術(shù)來分析父母單倍型。其原理是利用基因位點的空間接近性，交聯(lián)感興趣基因周圍的序列（包含致病突變），選擇性地反向PCR擴增并測序，有相同變化的被分為一個單倍型。隨后，分離母體血漿中cffDNA，富集突變位點的片段并進行測序，用單倍型數(shù)據(jù)和cffDNA數(shù)據(jù)推斷胎兒的遺傳狀態(tài)；該方法在18例妊娠婦女中得到驗證，主要包括CFTR、CYP21A2和HBB基因，與有創(chuàng)產(chǎn)前診斷結(jié)果一致，在妊娠早期階段（8周）即可做出診斷。但將這種方法用于由基因重復(fù)引起的疾病上則需要進一步優(yōu)化。與linked-read測序技術(shù)相比，該方法不需要專門設(shè)備，在任何遺傳學實驗室都可較容易地實現(xiàn)，避免了測序的昂貴費用，對數(shù)據(jù)分析、存儲計算要求較低。在此基礎(chǔ)上，Vermeulen等［23］提出，需要經(jīng)過大規(guī)模的臨床試驗，才能驗證兩種方法在敏感性和準確性、成本效益方面誰更優(yōu)異。

3 臨床應(yīng)用中NIPD面臨的問題

如何在臨床中應(yīng)用NIPD仍面臨許多問題，有一些局限性需要考慮，包括實驗方法的有效性，尤其涉及罕見突變，胎兒DNA的比例及樣本處理流程，檢測費用等，同時建立質(zhì)量保證體系也很必要。

3.1 母體血漿中胎兒DNA的比例 母體血漿中細胞游離DNA來源于母親細胞和胎盤滋養(yǎng)層細胞的凋亡。雖然胎兒游離DNA大約占5%～10%，且隨著孕周增加而增加，但其相對數(shù)量在孕期是高度變化的，影響因素包括孕周、胎盤大小、母親是否吸煙、母親體質(zhì)量指數(shù)和母親是否有先兆子癇等［24］。考慮到這些不可預(yù)知的因素，NIPD時測量胎兒DNA的比例是非常重要的質(zhì)控參數(shù)。尤其是出現(xiàn)陰性結(jié)果時，有可能是胎兒DNA濃度低于檢測范圍［5］。

有多種方法可以測量胎兒DNA在母體血漿中的比例，包括片段大小、上下游序列、甲基化的不同、男胎出現(xiàn)Y染色體、顯示父源性遺傳的SNP等［25］。胎兒DNA的比例很難準確測定，尤其濃度低時，各方法之間也有差異。應(yīng)用NIPD時測量胎兒DNA在母體血漿DNA中的比例，可以作為質(zhì)控參數(shù)。

3.2 樣本處理和DNA提取 母體血漿細胞游離DNA是母親DNA和胎兒DNA的混合物。當用EDTA抗凝管采集母體外周血后，母體白細胞會繼續(xù)降解，使得其游離DNA比例相對增加。所以臨床應(yīng)用NIPD之前，需要進一步研究樣本處理及其處理時間，取血后必須盡快分離血漿以維持胎兒DNA的最大比例。這點對NIPD尤為重要，因為NIPD是依賴相對突變或單倍型分析，而不是直接檢測有無突變。當不能及時分離血漿時，需采用維持細胞穩(wěn)定的采血管，以減少溶血，使胎兒DNA比例最大化［5］。

無論是人工還是自動提取DNA的方法，都需要經(jīng)過長期評估，以優(yōu)化提取方法，確保短的胎兒DNA片段能被有效提取。采用的方法很大程度上依靠樣本量，優(yōu)化流程后即能產(chǎn)生相對高質(zhì)量的DNA。

臨床工作中，監(jiān)管樣本類型和處理時間也是必須的。必須提供清晰的樣本處理和運輸流程，以優(yōu)化下游的DNA提取和檢測。

3.3 假陽性和假陰性 在NIPD中可以觀察到假陽性，特別在孕早期，可能是由于存在1個未被發(fā)現(xiàn)的雙胞胎，但由于胚胎停止發(fā)育而未被發(fā)現(xiàn)，影響NIPD結(jié)果，可以通過超聲掃描來避免此種情況的出現(xiàn)［2］。低比例的母體嵌合也可能導致假陽性結(jié)果，可以同時分析母體基因組DNA以避免。由于母體血漿中cffDNA濃度低，極易發(fā)生假陰性，因此Hayward等［2］建議在NIPD時同時識別父源性遺傳等位基因、Y染色體序列或雜合SNPs或進行RASSF1A分析，以證明胎兒DNA的存在。

3.4 質(zhì)量控制 無論什么新方法應(yīng)用到NIPD中，確定其準確性和可靠性是非常重要的。每次試驗及臨床應(yīng)用時，都需要質(zhì)量控制。NIPD中，質(zhì)控參數(shù)包括最小測序深度和胎兒DNA比例。如果胎兒比例過小，需隨著孕周增大再重復(fù)實驗。為了符合醫(yī)學實驗室國際標準，如ISO 15189:2012，實驗室需要參加室間質(zhì)評（EQA），但是仍有一些特殊設(shè)計的NIPD設(shè)計較難，費用高，無法參加EQA。實驗室之間樣本交換可以解決這一問題，但缺乏可操作性。如果結(jié)果不滿意，尚未找到有效的解決方法［5］。

3.5 費用 產(chǎn)前分子診斷的局限性之一就是費用問題。因為父母需要早期無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的結(jié)果，相應(yīng)的實驗室投入增加，所以費用也在升高。使用NGS方法或增加病例研究，可能降低費用。增加樣本量也可以降低費用，但需要在選定的實驗室集中測試。Verhoef等［26］研究顯示，對于父源性突變或新發(fā)突變，每周無創(chuàng)產(chǎn)前診斷2～3例樣本，NIPD較侵入性診斷便宜；在用RHDO方法確診囊性纖維化等隱性遺傳病或特殊設(shè)計NIPD檢測方法時，費用較有創(chuàng)檢測增加一百多英鎊；假基因的存在使分析復(fù)雜并增加成本500～900英鎊。而遇到罕見遺傳病時開發(fā)NIPD并不合算。但隨著測序成本的下降，經(jīng)濟形勢將發(fā)生變化，NIPD的價格將變得更加低廉，更容易被接受。

4 結(jié)語與展望

利用母體血漿DNA無創(chuàng)產(chǎn)前診斷胎兒單基因遺傳病是產(chǎn)前診斷的巨大進步，診斷疾病的種類在逐漸增加，從最初只能鑒定是否遺傳父源性突變，到可以分析更為復(fù)雜的隱性遺傳病、X連鎖遺傳病和母源性顯性遺傳病，而且避免了有創(chuàng)產(chǎn)前診斷帶來的流產(chǎn)等風險，使得有家族史的夫婦可以獲得早期安全的產(chǎn)前診斷。

但臨床應(yīng)用中NIPD仍面臨許多挑戰(zhàn)，對于復(fù)雜的單基因遺傳病或罕見突變，試驗過程繁瑣，費用較高，其大規(guī)模用于臨床還有一段時間。隨著NIPD的發(fā)展，在今后的臨床實踐中，還需制定檢測標準和指導方針，建立質(zhì)量保證體系和專業(yè)培訓，以及商討可能出現(xiàn)的倫理問題。