李夏瑩， 高鴻飛， 劉鵬程， 王顥潛， 梁晉剛， 張旭冬， 李文龍， 張秀杰

(1.農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心，北京 100176； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北武漢 430062)

轉(zhuǎn)基因生物(genetically modified organism，GMO)一般是指通過基因工程技術(shù)將具有特殊功能的外源基因轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)，使其表達(dá)，從而使生物體獲得它本身不具有的新特性，這樣一類獲得外源基因的生物稱之為轉(zhuǎn)基因生物[1-4]。當(dāng)前轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物領(lǐng)域。據(jù)統(tǒng)計，自1996年轉(zhuǎn)基因作物被允許商業(yè)化種植以來，截至2016年，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積從170萬hm2增加到 1.851億hm2，增加了110倍。21年間(1996—2016年)，全球轉(zhuǎn)基因作物累計種植面積達(dá)到空前的21億hm2[5]。目前有美國、阿根廷、加拿大等26個國家種植了轉(zhuǎn)基因作物，其中19個為發(fā)展中國家，7個發(fā)達(dá)國家。發(fā)展中國家的種植面積占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的54%，而發(fā)達(dá)國家的種植面積占46%。已經(jīng)商業(yè)化大面積種植的轉(zhuǎn)基因作物種類主要是玉米、大豆、棉花和油菜。除此之外，轉(zhuǎn)基因作物也擴(kuò)展到了甜菜、木瓜、茄子、馬鈴薯以及2017年剛上市的蘋果等。

轉(zhuǎn)基因作物的迅速普及，為農(nóng)民乃至為全社會帶來了巨大的農(nóng)業(yè)、經(jīng)濟(jì)和社會效益，但同時也引發(fā)了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對人體健康和生態(tài)環(huán)境的廣泛爭論。為了滿足廣大消費者的知情權(quán)和選擇權(quán)以及國際貿(mào)易的需求，許多國家或地區(qū)相繼出臺了轉(zhuǎn)基因生物安全管理相關(guān)法律法規(guī)。目前已有65個國家或地區(qū)對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實行強(qiáng)制標(biāo)志管理制度，如日本和韓國等國家的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)志制度要求產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分含量超過5%或者3%的必須實施標(biāo)志，而歐盟的要求更為嚴(yán)格，要求0.9%以上必須標(biāo)志。我國于2001年也公布并實施了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》，并于同年公布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》等3個配套管理辦法，要求對農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物目錄的產(chǎn)品進(jìn)行嚴(yán)格的標(biāo)志管理制度[6]。然而，近年來轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品非法進(jìn)口、污染及安全事故等事件不斷增加，因此，加大對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測監(jiān)管十分必要。隨著轉(zhuǎn)基因作物的種植面積以及相關(guān)國際貿(mào)易的不斷增加，建立簡單便捷的轉(zhuǎn)基因現(xiàn)場檢測和快速篩查方法對于實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的有效監(jiān)管十分關(guān)鍵。

目前對轉(zhuǎn)基因作物的檢測方法主要分為2類：第一類是基于外源基因檢測的PCR方法，該方法是通過PCR技術(shù)和核酸探針的雜交檢測技術(shù)來準(zhǔn)確、快速地檢測外源基因；二是基于外源基因表達(dá)的特異性蛋白檢測的免疫方法，這類方法是利用制備的特異性抗體和轉(zhuǎn)基因作物中表達(dá)的外源蛋白的免疫結(jié)合來實現(xiàn)特異、快速的轉(zhuǎn)基因分析。對于外源蛋白的快速檢測主要采用酶聯(lián)免疫吸附分析、免疫層析分析和生物傳感器分析等方法。對于外源基因的快速檢測方法主要采用基因組DNA直接提取法、核酸等溫擴(kuò)增法以及核酸試紙條等方法?，F(xiàn)將目前廣泛使用的幾種轉(zhuǎn)基因作物快速檢測技術(shù)綜述如下：

1 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)指將抗原或者抗體結(jié)合到固相載體上，利用抗原抗體特異性反應(yīng)將待測物與酶連接，最后通過酶與底物顯色來進(jìn)行定性或者定量的檢測方法[7]。

這一方法的基本原理是：(1)首先將抗原或者抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體表面，該過程在溫和條件下進(jìn)行以利于保持免疫吸附劑的免疫活性。(2)同時將酶標(biāo)記相應(yīng)的抗原或者抗體以制備信號探針，該信號探針分子既保留免疫物質(zhì)的免疫活性，又保留酶的活性。(3)在測定中，待測物和信號探針按照不同的步驟與固相載體表面的抗原或者抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，經(jīng)過洗滌等理化步驟使固相載體上結(jié)合的免疫復(fù)合物與溶液中游離的免疫物質(zhì)分離，此時固定的酶量與待測物的量成一定的比例。(4)最后向固相載體上加入酶反應(yīng)的底物，底物被酶催化而發(fā)生顏色變化，根據(jù)產(chǎn)物的顏色深淺對待測物進(jìn)行定性或定量分析。

根據(jù)操作步驟的不同，該法通?？煞譃閵A心法、競爭法和間接法3種類型。

相比于其他方法，該測定法是基于抗原抗體的特異性反應(yīng)，因此具有高度的特異性并且無需復(fù)雜的樣品前處理。同時在該測定法中酶標(biāo)記物較穩(wěn)定，試劑保存期長；產(chǎn)生的信號用普通的可見-紫外分光光度計就可測定，不需要昂貴的儀器設(shè)備，因此檢測成本低廉。此外該方法還具有操作簡單，檢測快速，易于標(biāo)準(zhǔn)化操作等優(yōu)點?；谝陨咸攸c，ELISA已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究和臨床實驗診斷工作等領(lǐng)域中，并已成為商業(yè)化程度最高的免疫分析方法。

目前應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測的ELISA試劑盒已被成功開發(fā)，如EnviroLogix公司的Cry1Ab/Cry1Ac定量檢測試劑盒和CP4-EPSPS定量檢測試劑盒等。

Tan等利用豌豆種子提取的CpT1蛋白制備相應(yīng)的單抗，隨后與辣根過氧化物酶標(biāo)記，建立了雙抗夾心式ELISA法，可實現(xiàn)快速、有效的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花檢測[8]。

值得注意的是在ELISA法中標(biāo)記酶不像同位素/熒光標(biāo)記物那樣能直接產(chǎn)生信號，而必須要和其他試劑，如酶底物、輔酶的參與，才能完成酶反應(yīng)，引起吸光譜等變化后方可進(jìn)行測定；同時由于采用肉眼可見的比色法檢測，使得其靈敏度受到一定的限制。

2 試紙條法

試紙條(test strip)是近年來興起的一種基于薄層層析膜的分析方法。試紙條通常是由樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜和吸收墊組成。反應(yīng)膜上存在檢測線和質(zhì)控線。該分析方法的基本原理是樣品加入樣品墊后，在反應(yīng)膜毛細(xì)管作用下和結(jié)合墊上的示蹤分子一起流經(jīng)固定有生物識別分子的檢測線，并與固定的生物識別分子發(fā)生反應(yīng)形成復(fù)合物，繼而在檢測區(qū)域顯示示蹤分子的顏色，實現(xiàn)對待測樣品的檢測。

在試紙條中，反應(yīng)膜的功能是利用其對生物大分子的吸附特性而固定抗體等物質(zhì)，同時驅(qū)使樣品以及示蹤分子流向反應(yīng)區(qū)域。因此該反應(yīng)膜需具備良好的蛋白吸附能力，并且需要具有一定的孔隙度和濕潤性以保證水溶性樣品的毛細(xì)遷移，目前應(yīng)用最廣泛的是硝酸纖維素膜。

根據(jù)檢測物質(zhì)的種類不同，試紙條可分為免疫層析試紙條(immunochromatographic test strip)和核酸試紙條(nucleic acid test strip)。

2.1 免疫層析試紙條法

免疫層析試紙條是將薄層層析分析與傳統(tǒng)的免疫分析相結(jié)合而發(fā)展的一種新型分析方法[9-12]。

免疫層析試紙條的基本原理是將特異性抗體預(yù)先固定在硝酸纖維素膜的檢測區(qū)域，當(dāng)膜的一端浸入樣品后，在毛細(xì)管作用下，樣品將沿著該反應(yīng)膜向前遷移。當(dāng)移動至固定有抗體的區(qū)域時，樣品中待測的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合。若用免疫膠體金示蹤或者免疫酶染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實現(xiàn)快速簡便的免疫分析。

相比于傳統(tǒng)的免疫分析，如ELISA法等，免疫層析試紙條無需較長的孵育時間和多步清洗步驟，因此可以顯著簡化分析流程，縮短分析時間，已成為體外快速診斷領(lǐng)域發(fā)展的趨勢性方法。

目前在免疫層析試紙條中應(yīng)用最為廣泛的是膠體金免疫層析技術(shù)(gold immunochromatographic assay，GICA)[13-16]。該技術(shù)具有操作簡單快速、結(jié)果容易判定、安全無污染等優(yōu)點。GICA的基本原理是以硝酸纖維素膜為固相載體，以膠體金作為示蹤標(biāo)記物來標(biāo)記抗體，在反應(yīng)膜毛細(xì)管作用下，基于抗原抗體的特異性反應(yīng)和膠體金特有的顏色對金標(biāo)抗體與抗原的免疫結(jié)合進(jìn)行示蹤，顯示肉眼可見的紅色條帶，從而實現(xiàn)對待測物的現(xiàn)場快速檢測。

根據(jù)膠體金標(biāo)記目標(biāo)物的不同通?？煞譃閵A心法和競爭法。夾心法主要針對大分子待測物，而對于小分子待測物因其分子量比較小，空間結(jié)構(gòu)簡單，一般采用競爭法。

在夾心法中，當(dāng)檢測線和質(zhì)控線均出現(xiàn)肉眼可見的色帶時，表明結(jié)果判讀為陽性。僅質(zhì)控線出現(xiàn)肉眼可見的色帶，則結(jié)果判讀為陰性。在競爭法中，結(jié)果判讀與之相反。值得說明的是無論哪種分析類型，若質(zhì)控線未出現(xiàn)肉眼可見的色帶，則表明試紙條變質(zhì)失效。

膠體金免疫層析試紙條在轉(zhuǎn)基因成分檢測中發(fā)揮了日益重要的作用。如美國檢測StarLink玉米中的Cry9C蛋白的試紙條已成為美國官方的檢測方法。在國內(nèi)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所研制的Cry1Ab/Ac蛋白檢測試紙條等產(chǎn)品已經(jīng)量化生產(chǎn)并得到農(nóng)業(yè)部的推薦使用。

此外，Kumar等合成營養(yǎng)期殺蟲蛋白(Vip)的重組抗原，并制備相應(yīng)的抗體，將膠體金標(biāo)記抗體作為信號探針，繼而制備免疫層析試紙條。該方法基本無交叉干擾，可實現(xiàn)快速、靈敏、特異的轉(zhuǎn)基因檢測[17]。

免疫層析試紙條是一種快速簡便的定性檢測方法，將試紙條放在待測樣品抽提物中，5～10 min就可得出結(jié)果，不需要特殊儀器和熟練技能。轉(zhuǎn)基因蛋白快速檢測試紙條的成功研制，為轉(zhuǎn)基因作物的篩查和監(jiān)管提供了有力的技術(shù)支持平臺。這類試紙條非常適合于可以強(qiáng)表達(dá)外源蛋白的Cry1Ab/Ac、CP4EPSPS和bar等基因的快速篩查。按照合適的采樣步驟，免疫層析試紙條可以在給定的一批樣品中以99%的置信水平檢測出少于0.15%的轉(zhuǎn)基因成分。

但是目前大多數(shù)商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因蛋白試紙條只能檢測1種蛋白質(zhì)，并且無法有效地檢測外源蛋白發(fā)生降解或者結(jié)構(gòu)改變的深加工的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品等。同時蛋白檢測試紙條只能檢測有無外源蛋白存在而不能識別不表達(dá)蛋白的特異轉(zhuǎn)化元件，以及區(qū)分具體的轉(zhuǎn)基因品種。

2.2 核酸試紙條法

核酸試紙條是將聚合酶鏈反應(yīng)與試紙條技術(shù)結(jié)合而發(fā)展的一種分析方法[18-19]。

核酸試紙條的基本原理通常是利用一對分別修飾有熒光素和生物素的特異性引物擴(kuò)增待測核酸。擴(kuò)增產(chǎn)物無需純化，加入試紙條后，在毛細(xì)管作用下向前遷移。當(dāng)有擴(kuò)增產(chǎn)物存在時，一端修飾有生物素的擴(kuò)增產(chǎn)物首先與結(jié)合墊上標(biāo)記鏈霉親和素的示蹤分子結(jié)合，繼而被捕獲在固定有熒光素抗體的檢測線上，產(chǎn)生示蹤分子的顏色條帶。無論擴(kuò)增產(chǎn)物存在與否，修飾有親和素的示蹤分子都會被固定在質(zhì)控線上的生物素所捕獲，以完成對核酸試紙條的質(zhì)控。

核酸試紙條技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測方面已經(jīng)有了成功的報道。如Kalogiani等首次構(gòu)建了基于膠體金作為示蹤標(biāo)記物的核酸試紙條，用于檢測轉(zhuǎn)基因大豆中特異轉(zhuǎn)化元件CaMV35s和NOS。該方法靈敏度高、操作簡單、檢測快速、結(jié)果能夠用裸眼判讀、無需特殊檢測儀器[20]。

最近，Cheng等利用DNA酶增強(qiáng)的膠體金作為示蹤物質(zhì)，建立基于多標(biāo)記環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的多組分核酸試紙條，用于檢測多個轉(zhuǎn)化事件堆積的轉(zhuǎn)基因大豆(DP305423×GTS 40-3-2)。該方法能夠靈敏、特異、簡單、快速地實現(xiàn)具有復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因作物的現(xiàn)場檢測[21]。

核酸試紙條可以不依賴較為繁瑣耗時的電泳檢測技術(shù)或者較為昂貴的熒光檢測儀，能夠大大縮短核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測時間，降低分析成本，并能準(zhǔn)確識別特異性轉(zhuǎn)化元件，尤其適用于深加工的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品或者具有復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的快速檢測。但是由于修飾的特異性引物在擴(kuò)增過程中會產(chǎn)生引物間二聚體，因此會導(dǎo)致核酸試紙條出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。同時擴(kuò)增產(chǎn)物易受到交叉污染，因此核酸試紙條常需要配置防污染封閉式裝置，從而提高了試紙條成本。

3 轉(zhuǎn)基因生物傳感器檢測

生物傳感器(biosensor)是生物、化學(xué)、物理、電子信息技術(shù)等多種學(xué)科互相滲透而發(fā)展的一種高新技術(shù)[22-24]。生物傳感器由生物敏感膜和理化換能器組成，其基本原理是分析物擴(kuò)散進(jìn)入固定化生物敏感膜層，經(jīng)分子識別，發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生響應(yīng)信號，該信號繼而被相應(yīng)的理化換能器轉(zhuǎn)變成可處理的光電信號，再經(jīng)檢測放大器放大并輸出，從而實現(xiàn)對待測分析物的檢測。生物敏感膜又稱分子識別元件，是生物傳感器的關(guān)鍵元件，可以由酶、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、組織和核酸等生物活性物質(zhì)組成。換能器又稱信號轉(zhuǎn)換元件，其作用是將各種生化和物理的信息轉(zhuǎn)換成光電信號，通常包括電化學(xué)電極、光敏元件、熱敏元件、半導(dǎo)體和壓電裝置等。

根據(jù)使用的識別元件的不同，生物傳感器可分為酶傳感器、免疫傳感器、微生物傳感器、細(xì)胞生物傳感器和組織生物傳感器等。根據(jù)信號轉(zhuǎn)化方式的不同又可分為電化學(xué)生物傳感器、光學(xué)生物傳感器、熱生物傳感器、壓電生物傳感器和磁生物傳感器等。

生物傳感器具有靈敏度高、選擇性好、分析速度快、分析通量高、成本低以及在復(fù)雜體系中進(jìn)行在線連續(xù)監(jiān)測等突出優(yōu)點。特別是非常容易實現(xiàn)高度自動化、微型化和集成化，使得生物傳感器在多個研究領(lǐng)域獲得廣泛的關(guān)注和蓬勃的發(fā)展。生物傳感器非常適合轉(zhuǎn)基因的現(xiàn)場檢測和快速篩查，并已在相關(guān)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品研究中取得了突破性進(jìn)展。

目前，應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測研究的生物傳感器主要有光學(xué)生物傳感器如表面等離子共振傳感器、壓電生物傳感器如石英晶體微天平傳感器、電化學(xué)生物傳感器等。

Mariotti等構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因檢測表面等離子共振傳感器。能夠識別35S啟動子或NOS終止子序列的單鏈DNA探針首先被固定在傳感器芯片表面，繼而與轉(zhuǎn)基因大豆中提取并擴(kuò)增的目標(biāo)轉(zhuǎn)基因片段發(fā)生雜交反應(yīng)。通過監(jiān)控雜交前后信號的變化可以實現(xiàn)簡單、特異和快速的轉(zhuǎn)基因檢測[25]。該研究團(tuán)隊同時開發(fā)了轉(zhuǎn)基因檢測石英晶體微天平傳感器。將寡核苷酸探針固定在傳感器表面，同時提取并擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因作物的基因組DNA，再經(jīng)熱變性、磁分離和酶作用獲得單鏈DNA片段，通過檢測目標(biāo)DNA分子與固定的核酸探針雜交后的信號變化實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因成分分析[26]。

最近，Zhou等提出了一種電化學(xué)傳感器，用于檢測轉(zhuǎn)基因外源蛋白。在研究中，特異性的納米抗體作為識別元件并修飾在電極上，通過π-π交聯(lián)的石墨烯/硫槿復(fù)合物作為電化學(xué)信號探針并標(biāo)記納米二抗。該復(fù)合探針不僅可以提供大量的抗體結(jié)合位點而且具有高效的電子轉(zhuǎn)移效率，因此能夠?qū)崿F(xiàn)高特異、高靈敏分析[27]。

然而，由于傳感器中生物識別元件具有不穩(wěn)定性和易變性等缺點，使生物傳感器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差。目前大量研究工作還處于針對轉(zhuǎn)基因生物傳感器檢測方法學(xué)的初步建立階段，離傳感器的商業(yè)化應(yīng)用還有較長的距離。

4 基因組DNA直接提取法

在核酸分析中，常常涉及一系列操作步驟，包括樣品研磨，核酸提取，PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析或者熒光檢測。DNA提取的方法有很多，如CTAB法、核酸提取試劑盒法等。但是這些方法需要繁瑣的核酸抽提、沉淀、洗脫等多個步驟以及數(shù)個小時的提取時間，并且CTAB法需要用到氯仿等有毒試劑，而試劑盒提取成本較高。因此，傳統(tǒng)的核酸提取方法不利于大量樣品的分析和檢測，難以滿足建立在核酸分析基礎(chǔ)上開展的大規(guī)?，F(xiàn)場快速檢測分析的要求。

為了克服以上技術(shù)難題，基因組DNA直接提取法(genomic DNA direct-extraction assay)近年來被開發(fā)出來。該方法的基本原理是利用EDTA、表面活性劑、蛋白變性劑以及緩沖液等物質(zhì)混合成裂解液，在適宜溫度下，10 min內(nèi)即可一步完成樣品中基因組DNA的提取，提取的DNA無需純化即可直接作為PCR模板進(jìn)行有效擴(kuò)增。與已有的DNA提取方法相比，該直接提取法可大大縮短DNA提取時間，減少操作的繁瑣性，實現(xiàn)核酸分析法的快速檢測和大量篩查。

基因組DNA直接提取法已成功應(yīng)用于動物組織DNA提取、植物侵染病毒檢測以及病原菌監(jiān)測等領(lǐng)域。目前，該方法也開始應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測，如中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所研制的轉(zhuǎn)基因直擴(kuò)檢測試劑盒等。

然而這類直接快速提取試劑盒在DNA純度，分析靈敏度等方面要遜色于傳統(tǒng)的核酸提取方法。轉(zhuǎn)基因直擴(kuò)試劑盒能夠檢測大部分研磨后的轉(zhuǎn)基因作物種子和葉片樣品，但是對于含油脂較多的油菜等樣品，其分析性能需要進(jìn)一步提高。

5 核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)

核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)(nucleic acid isothermal amplification)是能在某一特定的溫度下擴(kuò)增特定的DNA或者RNA的一類分子生物學(xué)技術(shù)的總稱。與PCR技術(shù)相比，核酸等溫擴(kuò)增對儀器的要求大大簡化，反應(yīng)時間大大縮短，更能滿足快速簡便檢測的需求。

核酸等溫擴(kuò)增可分為環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)，依賴于核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)(NASBA)，滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)，單引物等溫擴(kuò)增技術(shù)(SPIA)，依賴于解旋酶的等溫擴(kuò)增技術(shù)(HAD)，鏈替代擴(kuò)增技術(shù)(SDA)，快速等溫檢測放大技術(shù)(RIDA)，切刻內(nèi)切酶核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)(NEMA)。

應(yīng)用較為廣泛的是LAMP技術(shù)[28-31]。該技術(shù)的基本原理是利用2對特殊設(shè)計的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，使反應(yīng)中在模板兩端引物結(jié)合處循環(huán)出現(xiàn)環(huán)狀單鏈結(jié)構(gòu)，從而保證引物可以在等溫條件下順利與模板結(jié)合，并進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過熒光定量PCR儀或者利用核酸擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的焦磷酸鎂沉淀反應(yīng)用濁度儀進(jìn)行檢測。

LAMP核酸擴(kuò)增在等溫條件下進(jìn)行，不需要預(yù)先的雙鏈DNA熱變性、溫度循環(huán)，同時使用4種特異性引物，產(chǎn)物檢測用肉眼即可判定，因此具有操作簡單、快速高效、特異性高、靈敏度高等特點。

LAMP技術(shù)已經(jīng)越來越多地被用于核酸分析，包括病原菌監(jiān)測、基因型分析和轉(zhuǎn)基因檢測。最近，Shen等建立了1種快速可視化檢測轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻和棉花中Cry1A基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法。該LAMP分析在能夠識別Cry1A基因序列的6個區(qū)域的4種特異性引物的存在，在65 ℃恒溫條件下，1 h內(nèi)即可以完成擴(kuò)增。該方法的靈敏度可以達(dá)到0.01%，比傳統(tǒng)的PCR方法提高了10倍[32]。

Shao等設(shè)計了1種基于LAMP技術(shù)的毛細(xì)管陣列平臺，可簡單、快速、可視化地同時檢測多組分轉(zhuǎn)基因靶基因。在所開發(fā)的微陣列中，LAMP引物被預(yù)先固定在毛細(xì)管內(nèi)壁。LAMP反應(yīng)混合物裝載至微陣列后能夠自行分離到每根毛細(xì)管中，繼而平行發(fā)生等溫擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物可以在手持UV裝置的照射下進(jìn)行可視化檢測。該方法已經(jīng)成功地實現(xiàn)4種常見轉(zhuǎn)基因特異轉(zhuǎn)化元件和5種不同轉(zhuǎn)基因作物的檢測，具有較為廣闊的應(yīng)用前景[33]。

值得注意的是LAMP是一種鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)，要求合適長度的靶基因序列，當(dāng)靶序列長度大于500 bp時較難擴(kuò)增，故不能進(jìn)行長鏈DNA的擴(kuò)增。該方法靈敏度較高，但是容易污染而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。LAMP技術(shù)需要多種特異性引物，這些引物設(shè)計較為復(fù)雜。

6 結(jié)論與展望

目前常用的轉(zhuǎn)基因作物快速檢測方法是基于外源蛋白或者外源基因檢測的分析方法。基于蛋白質(zhì)的分析方法無需較為繁瑣的樣品前處理和較為昂貴的檢測儀器，尤其是免清洗的免疫層析試紙條技術(shù)，能夠顯著縮短分析時間，非常適合轉(zhuǎn)基因作物的田間地頭的快速篩查。但是對于不表達(dá)外源蛋白的一些外源基因，如CaMV35s、NOS等轉(zhuǎn)化元件，傳統(tǒng)的蛋白快速檢測試紙條無法完成有效檢測，需要構(gòu)建基于核酸分析的快速檢測方法，對目前已有的轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)快速檢測方法做有效補(bǔ)充，從而構(gòu)建完整的轉(zhuǎn)基因快速檢測體系，以有效支撐轉(zhuǎn)基因相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展和管理。

在轉(zhuǎn)基因PCR分析中，需要繁瑣耗時的核酸提取步驟，同時擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測高度依賴較昂貴的熒光檢測儀器或者較復(fù)雜的電泳檢測技術(shù)，這些方面顯著限制了PCR方法的現(xiàn)場快速簡便檢測。近年來發(fā)展的基因組DNA直接提取法，可以在幾分鐘內(nèi)一步完成轉(zhuǎn)基因作物粉末樣品中DNA的提取，大大縮短核酸的提取時間，但是其分析適用性有待進(jìn)一步提高。另一項技術(shù)LAMP技術(shù)對儀器要求不高且結(jié)果可視，但是對引物設(shè)計的要求很高。

隨著轉(zhuǎn)基因作物品系的不斷增加，現(xiàn)有的常規(guī)檢測方法已不能滿足靈敏、快速、定量及高通量的要求，從而對轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)提出了更高的要求。如何將各種已有的檢測技術(shù)結(jié)合起來，建立高效、快速、簡便及低成本的檢測方法，將成為今后轉(zhuǎn)基因快速檢測技術(shù)研究的發(fā)展趨勢。近年來興起的轉(zhuǎn)基因生物傳感器檢測，有望實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因高度自動化、微型化和集成化檢測；同時，具有大規(guī)模、高通量、高靈敏等優(yōu)勢的質(zhì)譜技術(shù)有望解決轉(zhuǎn)基因蛋白準(zhǔn)確定量比較的難題，這些方法是轉(zhuǎn)基因快速檢測技術(shù)今后發(fā)展的方向。以具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景的轉(zhuǎn)基因新品系和帶有復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因作物為研究對象，探索免疫層析試紙條同時檢測多種轉(zhuǎn)基因成分的方法和條件，實現(xiàn)高通量轉(zhuǎn)基因檢測的目的，提高檢測效率，是現(xiàn)今轉(zhuǎn)基因快速檢測技術(shù)亟待解決的重點技術(shù)問題。

參考文獻(xiàn)：

[1]Deisingh A K，Badrie N. Detection approaches for genetically modified organisms in foods[J]. Food Research International，2005，38(6)：639-649.

[2]Anklam E，Gadani F，Heinze P，et al. Analytical methods for detection and determination of genetically modified organisms in agricultural crops and plant-derived food products[J]. European Food Research and Technology，2002，214(1)：3-26.

[3]姚文國，朱水芳. 轉(zhuǎn)基因食品檢驗分析技術(shù)概述[J]. 糧油食品科技，2003，11(1)：26-28.

[4]楊銘鐸，張春梅，華 慶，等. 轉(zhuǎn)基因食品快速檢測技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)，2004，25(11)：424-427.

[5]國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織.2016年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢[J]. 中國生物工程雜志，2017，37(4)：1-8.

[6]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法[Z]. 北京：中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2002.

[7]Xu W，Huang K，Deng A，et al. Enzyme linked immunosorbent assay for PAT protein detection in genetically modified rape[J]. Chinese Journal of Agricultural Biotechnology，2006，3：177-181.

[8]Tan G Y，Nan T G，Gao W，et al. Development of monoclonal Antibody-Based sensitive sandwich ELISA for the detection of antinutritional factor cowpea trypsin inhibitor[J]. Food Analytical Methods，2013，6(2)：614-620.

[9]Zou Z X，Du D，Wang J，et al. Quantum dot-based immunochromatographic fluorescent biosensor for biomonitoring trichloropyridinol，a biomarker of exposure to chlorpyrifos[J]. Analytical Chemistry，2010，82(12)：5125-5133.

[10]Du D，Wang J，Wang L M，et al. Integrated lateral flow test strip with electrochemical sensor for quantification of phosphorylated cholinesterase：biomarker of exposure to organophosphorus agents[J]. Analytical Chemistry，2012，84(3)：1380-1385.

[11]Liu C Y，Jia Q J，Yang C H，et al. Lateral flow immunochromatographic assay for sensitive pesticide detection by using Fe3O4 nanoparticle aggregates as color reagents[J]. Analytical Chemistry，2011，83(17)：6778-6784.

[12]Lin Y Y，Wang J，Liu G D，et al. A nanoparticle label/immunochromatographic electrochemical biosensor for rapid and sensitive detection of prostate-specific antigen[J]. Biosensors and Bioelectronics，2008，23(11)：1659-1665.

[13]Xu Y，Huang Z B，He Q H，et al. Development of an immunochromatographic strip test for the rapid detection of deoxynivalenol in wheat and maize[J]. Food Chemistry，2010，119(2)：834-839.

[14]Tang Y，Zhai Y F，Xiang J J，et al. Colloidal gold probe-based immunochromatographic assay for the rapid detection of lead ions in water samples[J]. Environmental Pollution，2010，158(6)：2074-2077.

[15]Zhou S H，Cui S J，Chen C M，et al. Development and validation of an immunogold chromatographic test for on-farm detection of PRRSV[J]. Journal of Virological Methods，2009，160(1/2)：178-184.

[16]van den Bulcke M，de Schrijver A，de Bernardi D，et al. Detection of genetically modified plant products by protein strip testing：an evaluation of real-life samples[J]. European Food Research and Technology，2007，225(1)：49-57.

[17]Kumar R，Singh C K，Kamle S，et al. Development of nanocolloidal gold based immunochromatographic assay for rapid detection of transgenic vegetative insecticidal protein in genetically modified crops[J]. Food Chemistry，2010，122：1298-1303.

[18]Takalkar S，Baryeh K，Liu Guodong. Fluorescent carbon nanoparticle-based lateral flow biosensor for ultrasensitive detection of DNA[J]. Biosensors and Bioelectronics，2017，98：147-154.

[19]Liu W J，Zhang M F，Liu X Y，et al. A Point-of-Need infrared mediated PCR platform with compatible lateral flow strip for HPV detection[J]. Biosensors and Bioelectronics，2017，96：213-219.

[20]Kalogianni D P，Koraki T，Christopoulos T K，et al. Nanoparticle-based DNA biosensor for visual detection of genetically modified organisms[J]. Biosensors and Bioelectronics，2006，21(7)：1069-1076.

[21]Cheng N，Shang Y，Xu Y C，et al. On-site detection of stacked genetically modified soybean based on event-specific TM-LAMP and a DNAzyme-lateral flow biosensor[J]. Biosensors and Bioelectronics，2017，91：408-416.

[22]Huang L，Zheng L，Chen Y J，et al. A novel GMO biosensor for rapid ultrasensitive and simultaneous detection of multiple DNA components in GMO products[J]. Biosensors and Bioelectronics，2015，66：431-437.

[23]Kalogianni D P，Koraki T，Christopoulos T K，et al. Nanoparticle-based DNA biosensor for visual detection of genetically modified organisms[J]. Biosensors and Bioelectronics，2006，21(7)：1069-1076.

[24]Li Y Q，Sun L，Liu Q，et al. Photoelectrochemical CaMV35S biosensor for discriminating transgenic from non-transgenic soybean based on SiO2@CdTe quantum dots core-shell nanoparticles as signal indicators[J]. Talanta，2016，161：211-218.

[25]Mariotti E，Minunni M，Mascini M. Surface plasmon resonance biosensor for genetically modified organisms detection[J]. Analytica Chimica Acta，2002，453(2)：165-172.

[26]Mannelli I，Minunni M，Tombelli S，et al. Quartz crystal microbalance (QCM) affinity biosensor for genetically modified organisms (GMOs) detection[J]. Biosensors and Bioelectronics，2003，18(2/3)：129-140.

[27]Zhou Q，Li G H，Zhang Y J，et al. Highly selective and sensitive electrochemical immunoassay of cry1C using nanobody and π-π stacked graphene oxide/thionine assembly[J]. Analytical Chemistry，2016，88(19)：9830-9836.

[28]Zhang M，Liu Y N，Chen L L，et al. One simple DNA extraction device and its combination with modified visual loop-mediated isothermal amplification for rapid on-field detection of genetically modified organisms[J]. Analytical Chemistry，2013，85(1)：75-82.

[29]Zhen Z，Zhang M H，Yu Y B，et al. Establishment of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) detection method for genetically modified maize MON88017[J]. European Food Research and Technology，2016，242(10)：1787-1793.

[30]Wang C，Li R，Quan S，et al. GMO detection in food and feed through screening by visual loop-mediated isothermal amplification assays[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2015，407(16)：4829-4834.

[31]Huang X，Chen L L，Xu J M，et al. Rapid visual detection of phytase gene in genetically modified maize using loop-mediated isothermal amplification method[J]. Food Chemistry，2014，156：184-189.

[32]Shao N，Chen J W，Hu J Y，et al. Visual detection of multiple genetically modified organisms in a capillary array[J]. Lab on a Chip，2017，17(3)：521-529.

[33]Shen P L，Geng F Z，Yu Y，et al. A rapid loop-mediated isothermal amplification method for detection of the modified GMcry1Agene in transgenic insect-resistant cotton and rice[J]. Food Control，2016，62：357-364.