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(1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457; 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山西太谷 030801)

硒是人體生命活動(dòng)的一種必需微量元素,主要參與酶的合成和細(xì)胞膜的保護(hù),適量的硒對(duì)于抗氧化、抗癌等具有積極的作用[1-3]。硒蛋白是富硒食物中主要的含硒成分之一,具有抗氧化、抗癌等生物活性。對(duì)富硒食用菌中硒蛋白的提取、純化及抗氧化活性已有報(bào)道[4-7],田敏爵對(duì)富硒猴頭硒蛋白不同溶劑提取效果比較后發(fā)現(xiàn),水提取液中蛋白質(zhì)含量最低[8],張卓研究得出盡管水溶性含硒蛋白在不同溶劑提取液中占的比例較低,但其同濃度下抗氧化活性最高[9]。水作為溶劑提取含硒蛋白能夠保持較好的蛋白活性,具有操作簡(jiǎn)單、避免使用較多化學(xué)試劑等優(yōu)點(diǎn)。目前對(duì)富硒平菇中硒蛋白的提取及抗氧化活性鮮見(jiàn)報(bào)道,因而本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化富硒平菇中水溶性蛋白提取的工藝參數(shù),同時(shí)對(duì)水溶性蛋白的體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià),為評(píng)價(jià)富硒平菇的抗氧化功能特性、開(kāi)發(fā)功能性富硒平菇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

富硒平菇 硒含量為622.47 mg/g的干樣,山西紫團(tuán)生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司;標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液、考馬斯亮藍(lán)G-250、95%乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、濃鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、雙氧水、硫酸亞鐵、三羥基氨基甲烷(Tris)、水楊酸、2,2-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、過(guò)硫酸鉀等 均為分析純。

MP200B電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;320-S pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SHY-2A水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠;SHZ-Ⅲ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;723可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司;TDL離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水溶性蛋白提取 稱取一定量的富硒平菇干樣,FW135高速粉碎機(jī)粉碎后過(guò)80目篩,按照一定料液比加入適量的蒸餾水,一定提取溫度下在磁力攪拌器中攪拌提取一定時(shí)間,抽濾至干,收集濾液,將殘?jiān)匦绿崛?次,合并濾液。根據(jù)溶液體積準(zhǔn)確稱量一定量的硫酸銨,邊攪拌邊向燒杯中緩慢加入硫酸銨至其飽和度為95%,分離沉淀部分并上3500 Da透析袋透析[5],最后冷凍干燥得水溶性蛋白樣品(SeP)。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 在對(duì)不同提取溫度(0、20、30、40、50 ℃)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)時(shí),固定料液比1∶30,提取時(shí)間4 h;在進(jìn)行不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)單因素實(shí)驗(yàn)時(shí),將提取溫度和提取時(shí)間固定在40 ℃、4 h;對(duì)不同提取時(shí)間(2、3、4、5、6 h)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)時(shí),固定料液比為1∶30、提取溫度為40 ℃。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn) 結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)得出富硒平菇中水溶性蛋白的最佳提取工藝條件范圍,為最大程度接近最佳工藝參數(shù),以水溶性蛋白濃度為實(shí)驗(yàn)指標(biāo),采用3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步縮小范圍,水平設(shè)置見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)方案Table 1 Design of orthogonal experiment

1.2.4 蛋白濃度的測(cè)定 分別取0.2 mg/mL的牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液1、2、3、4、5、6 mL于6個(gè)試管中,再加入蒸餾水至10 mL,混勻后移取混合液1 mL與5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染液在室溫下反應(yīng)10 min,在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(每個(gè)梯度都做3次平行實(shí)驗(yàn))。

分別準(zhǔn)確移取硫酸銨沉淀并透析后獲得的上清液1 mL于試管中,按照上述方法測(cè)定595 nm波長(zhǎng)處的OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中的蛋白質(zhì)濃度。參考鐵梅[10]的方法測(cè)定總硒含量。

水溶性蛋白濃度通過(guò)樣品測(cè)定吸光度值結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得。

1.2.5 水溶性蛋白抗氧化活性的測(cè)定

1.2.5.1 還原力 分別取1 mL不同濃度梯度的水溶性蛋白樣品液于5支試管中,加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH=6.6),再加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液,混合均勻后在50 ℃條件下恒溫水浴。靜置20 min后加入10%三氯乙酸2.5 mL,處理樣液以5000 r/min離心15 min,以1∶1∶0.2取上清液、蒸餾水、0.1%三氯化鐵溶液[11]混勻,在700 nm處測(cè)吸光值,以蒸餾水為空白。

1.2.5.3 羥自由基清除率 在試管中加入2 mL樣液,然后依次加入6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液和過(guò)氧化氫溶液各2 mL,靜置10 min后再加入6 mmol/L的水楊酸2 mL混勻,37 ℃水浴30 min后測(cè)定其在510 nm處的吸光值,記為A;空白組用2 mL蒸餾水代替樣液,測(cè)得的吸光值記為B;對(duì)照組用2 mL蒸餾水代替水楊酸,測(cè)得的吸光值記為C[13-14]。不同濃度梯度的水溶性蛋白溶液對(duì)羥自由基清除率按如下公式計(jì)算。

1.2.5.4 ABTS自由基清除率 用2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液配制7 mmol/L ABTS溶液,室溫下避光放置12～16 h,然后用磷酸鹽緩沖溶液稀釋使其734 nm下吸光度值為0.70±0.02,0.3 mL樣品溶液與3.7 mL稀釋后的ABTS溶液混合后在20 ℃下避光放置20 min,然后測(cè)定其在734 nm的吸光度值[15]。其中樣品和ABTS溶液混合后的吸光度值為A,而蒸餾水代替樣品后的吸光度值記為B,清除率計(jì)算公式如下。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用軟件SAS 9.0(SAS Institute Inc,USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,Sigma plot 10.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知,標(biāo)準(zhǔn)曲線在蛋白濃度0～0.12 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性。

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of bovine serum albumin

2.2 提取時(shí)間對(duì)水溶性蛋白濃度的影響

由圖2可知,在其他條件不變的情況下,富硒平菇水溶性蛋白濃度隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢(shì),在提取時(shí)間低于4 h時(shí)水溶性蛋白濃度較低,主要是因?yàn)槠焦街械牡鞍走€沒(méi)有充分溶解出來(lái),提取時(shí)間超過(guò)4 h后,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)水溶性蛋白浸出量達(dá)到飽和狀態(tài),濃度不再增加。因此選擇4 h為最佳提取時(shí)間。

圖2 提取時(shí)間對(duì)水溶性蛋白濃度的影響Fig.2 Effect of extracted time on the content of water soluble protein

2.3 提取溫度對(duì)水溶性蛋白濃度的影響

由圖3可知,在其它條件不變的情況下,富硒平菇水溶性蛋白濃度隨著提取溫度的增加呈上升趨勢(shì),在30～50 ℃時(shí)變化平緩,同時(shí)考慮到高溫條件下硒蛋白會(huì)變性,因而確定40 ℃為最佳的提取溫度。

圖3 提取溫度對(duì)水溶性蛋白濃度的影響Fig.3 Effect of extracted temperature on the content of water soluble protein

2.4 料液比對(duì)水溶性蛋白濃度的影響

由圖4可知,富硒平菇中水溶性蛋白濃度隨著料液比的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì),當(dāng)料液比為1∶30時(shí)達(dá)到最高,之后呈波動(dòng)性下降,考慮到后續(xù)的沉淀、透析、濃縮工藝,選擇1∶30作為合適的料液比。

圖4 料液比對(duì)水溶性蛋白濃度的影響Fig.4 Effect of lipid-to-solid ratio on the content of water soluble protein

2.5 正交實(shí)驗(yàn)

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以各因素選取的最佳水平作為正交實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn),為更接近因素水平最佳組合,在正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中將料液比和提取時(shí)間兩因素的水平范圍進(jìn)一步縮小,以水溶性蛋白濃度為指標(biāo),以料液比、提取時(shí)間及提取溫度為考察因素,進(jìn)行正交設(shè)計(jì),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

根據(jù)極差R的大小,確定影響因素的主次順序,可以看出A因素(提取溫度)為最重要因素,其次是B因素(料液比),C因素(提取時(shí)間)影響最小。通過(guò)理論分析得到,富硒平菇水溶性蛋白提取的最佳工藝條件為A1B2C2,9組實(shí)驗(yàn)中指標(biāo)最高組合為A1B2C2,二者一致,因而確定最佳工藝條件為A1B2C2,即提取溫度為30 ℃,料液比為1∶30,提取時(shí)間4 h。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),最終提取得到的水溶性蛋白濃度為(8.5±0.29) mg/mL,硒含量為325.7 μg/g。

在富硒平菇中,硒通過(guò)與蛋白質(zhì)、核酸、多糖等結(jié)合形成多種含硒化合物。提取硒蛋白的方法有水提、醇提、堿提等多種方法,考慮到提取方法的簡(jiǎn)便性、實(shí)驗(yàn)操作的安全性以及硒蛋白抗氧化研究對(duì)提取物純度的要求,本文選擇水提法。盡管水提法得到的硒蛋白含量相對(duì)較少,但是水提法引入的雜質(zhì)幾乎為零[4,16]。孫燈艷等[4]對(duì)富硒靈芝中的水溶性硒蛋白進(jìn)行提取,得到的最佳提取條件為pH=9,溫度為60 ℃,料液比(w/v)為1∶35,提取時(shí)間為9 h,提取次數(shù)為3次,在此條件下,蛋白提取的得率為51.56%,蛋白質(zhì)含量為83.7%,硒含量為533 μg/g。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的水溶性蛋白為全部蛋白質(zhì)的一部分,因而其含量較低,相關(guān)研究者也證實(shí)水溶性蛋白含量較其它溶劑提取的蛋白含量較低,含硒量較低的原因可能與原料本身富硒的量不同以及提取方法的不同有關(guān)。

2.6 水溶性蛋白的抗氧化活性

2.6.1 還原力 在還原力的測(cè)定過(guò)程中,抗氧化物質(zhì)提供電子,自由基獲取電子失去活性變?yōu)榉€(wěn)定的分子。在700 nm下,抗氧化物質(zhì)的吸光度值越大還原力越強(qiáng)。如圖5所示,在0.2～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi),隨著水溶性蛋白濃度的增加,還原力逐漸增大,當(dāng)水溶性蛋白濃度為1.0 mg/mL時(shí),還原力值達(dá)到1.38,但在相同濃度下VC還原力為1.67。水溶性蛋白中的抗氧化活性除與其中的蛋白有關(guān),還與其含有的硒元素有關(guān),因而水溶性蛋白在較低濃度下抗氧化活性相對(duì)較高。

圖5 水溶性蛋白的還原力Fig.5 Reduce power of water soluble protein with different contents

圖6 水溶性蛋白對(duì)超氧陰離子自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate for superoxide anion free radical of water soluble protein with different contents

2.6.3 羥自由基清除率 羥自由基是機(jī)體內(nèi)經(jīng)常會(huì)存在的一類有害自由基,羥自由基會(huì)透過(guò)細(xì)胞膜與蛋白、脂質(zhì)、多糖以及核酸發(fā)生反應(yīng)進(jìn)而對(duì)機(jī)體造成傷害,因而羥自由基的清除對(duì)保護(hù)機(jī)體的健康有重要的意義。在對(duì)羥自由基清除過(guò)程中,水溶性蛋白通過(guò)提供氫原子或自由電子與羥自由基形成穩(wěn)定的絡(luò)合化合物,從而降低羥自由基的含量。由圖7可知,水溶性蛋白在0.2～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)羥自由基的清除率隨著濃度的增加而增強(qiáng),其中在0.2～0.6 mg/mL范圍內(nèi)變化平緩,在0.6～1.0 mg/mL范圍內(nèi)變化較明顯,但都明顯低于同濃度下VC的清除率。當(dāng)濃度為1.0 mg/mL時(shí),水溶性蛋白和VC對(duì)羥自由基的清除率分別為56.4%和90.2%。楊奇[12]報(bào)道富硒金針菇、蟲(chóng)草硒蛋白對(duì)羥自由基的清除率隨硒蛋白濃度的增加而增加,且清除率顯著高于同濃度下空白蛋白和無(wú)機(jī)亞硒酸鈉,說(shuō)明硒與食用菌蛋白在清除自由基方面有協(xié)同作用。

圖7 水溶性蛋白對(duì)羥自由基的清除率Fig.7 Scavenging rate for hydroxyl free radical of water soluble protein with different contents

2.6.4 ABTS自由基清除率 由圖8可知,在所選蛋白濃度范圍內(nèi),水溶性蛋白對(duì)ABTS自由基的清除力隨濃度增加而增加,由0.2 mg/mL時(shí)的31.7%增加到1 mg/mL的56.2%,但同濃度下清除率都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于VC,其變化規(guī)律與對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率相似。

圖8 水溶性蛋白對(duì)ABTS自由基的清除率Fig.8 Scavenging rate for ABTS free radical of water soluble protein with different contents

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)確定了富硒平菇中水溶性蛋白提取的最佳工藝條件為料液比1∶30,提取時(shí)間4 h,提取溫度30 ℃,在此條件下提取得到的水溶性蛋白濃度為(8.5±0.29) mg/mL。水溶性蛋白對(duì)自由基的清除能力隨著濃度的增加而增大,

1.0 mg/mL的水溶性蛋白對(duì)超氧陰離子自由基、羥自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率分別為56.2%、51.9%、56.4%,反映還原力的OD700值達(dá)到1.38。

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