歐澤奎 劉東超 謝恩義 吳啟藩

(廣東海洋大學(xué) 湛江 524088)

全緣馬尾藻(Sargassum integerrimum)是一種中國(guó)特有的大型褐藻, 隸屬褐藻門, 墨角藻目, 馬尾藻科, 主要產(chǎn)于廣東省沿海。藻體雌雄異株, 自然生長(zhǎng)于低潮帶石沼中(曾呈奎等, 2000)。全緣馬尾藻具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值, 富含人體需要的不飽和脂肪酸(盧虹玉等, 2013a)。它還具有多種潛在的藥用價(jià)值, 研究發(fā)現(xiàn)從藻體中提取的多糖類物質(zhì)有神經(jīng)保護(hù)作用及抗氧化功能。此外, 藻體中還富含具有抗腫瘤、抗氧化效果的褐藻多酚類物質(zhì)(盧虹玉等, 2013b; Jin et al,2014; 肖為等, 2015)。全緣馬尾藻極具開發(fā)價(jià)值, 但目前全緣馬尾藻工廠化育苗程度低, 嚴(yán)重制約了其大規(guī)模栽培。

目前, 采苗量低是馬尾藻人工育苗中亟需解決的關(guān)鍵問題之一。研究表明, 導(dǎo)致雌雄異株類馬尾藻采苗量低的主要原因有兩個(gè)。一是生殖細(xì)胞排放量少、不同步, 導(dǎo)致可用于采苗的受精卵量少(Pang et al,2005; Fu et al, 2014)。二是一些馬尾藻的受精卵產(chǎn)生的假根部分會(huì)大量分泌“黏液”粘附在生殖托上(Inoh et al, 1932), 呈現(xiàn)“掛卵”的特性, 使得大多數(shù)受精卵不能在 24h內(nèi)脫落到采苗設(shè)施上(張婧, 2012), 從而導(dǎo)致受精卵在采苗設(shè)施上的附著率低(Pang et al,2005; Fu et al, 2014)。同時(shí), 馬尾藻的生殖托從完全成熟到生殖細(xì)胞排放完成之間的周期長(zhǎng)(徐金根,2013)。據(jù)此推測(cè)在馬尾藻人工育苗過程中可通過提高受精卵的脫落量來提高采苗率, 縮短促排時(shí)間和排卵時(shí)間來提高育苗效率。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道了羊棲菜(Hizikia fusiforme)、鼠尾藻(Sargassum thunbergii)、銅藻(Sargassum horneri)的生殖細(xì)胞排放規(guī)律, 以及通過改變溫度、鹽度、水流速度等關(guān)鍵環(huán)境條件可提高藻體的采苗量(Pang et al, 2005, 2006, 2009; Zou et al,2005; 王增福等, 2007; Liu et al, 2016),且有研究發(fā)現(xiàn)溫度、鹽度等環(huán)境因子是引發(fā)半葉馬尾藻(Sargassumhemiphyllum)、海黍子(Sargassum muticum) 生殖細(xì)胞釋放的關(guān)鍵因子(Kam et al, 2016; Kerrison et al,2016)。而目前關(guān)于全緣馬尾藻的生殖細(xì)胞排放規(guī)律未見報(bào)道, 其人工育苗技術(shù)的基礎(chǔ)研究很少, 僅見報(bào)道了溫度、水流速度及干出處理對(duì)幼孢子體生長(zhǎng)的影響(黃苑媚等, 2014; 孫宗紅等, 2015; 歐澤奎等,2016)。所以, 本文探究了全緣馬尾藻生殖細(xì)胞的排放規(guī)律以及溫度、鹽度和水流速度等主要環(huán)境因子的改變對(duì)排卵量、受精量、脫落卵量、促排時(shí)間和排卵時(shí)間的影響, 以期找到最適的人工促排條件, 進(jìn)而為提高人工育苗生產(chǎn)中的采苗率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

觀察實(shí)驗(yàn)及單因子實(shí)驗(yàn)材料: 2014年5月上旬從湛江市徐聞縣四塘村的近岸海域(110°08′E, 20°14′N)采集全緣馬尾藻成藻, 此時(shí)藻體上的生殖托剛開始成熟, 并可通過生殖托形狀辨別雌、雄藻體。觀察實(shí)驗(yàn)使用促熟的生殖托, 促熟條件為在溫度29°C、光照強(qiáng)度7000lx, 光照周期18h∶6h[光照(L)∶黑暗(D)]、鹽度33條件下充氣培養(yǎng)。單因子實(shí)驗(yàn)使用暫養(yǎng)成熟的生殖托, 在溫度(25±0.5)°C、光照強(qiáng)度(3000±100)lx,光照周期12h∶12h(L∶D)、鹽度 33±0.5條件下充氣暫養(yǎng)。雌、雄藻體上的生殖托同步達(dá)到完全成熟后,挑取托內(nèi)生殖細(xì)胞已成熟的雌、雄生殖托, 并用已消毒的手術(shù)刀將生殖托從藻體上取下后用于實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)液用已滅菌的PESI培養(yǎng)液, pH值8.2±0.2, 每天更換一次。正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)材料: 2015年5月上旬從同一海域采集并按上述單因子實(shí)驗(yàn)采用的方法處理。

論文中PESI培養(yǎng)液為PESI儲(chǔ)存液與消毒海水按照體積比 1∶49的比例混合而成的混合液。PESI儲(chǔ)存液的組成成分為, NaNO3、NH4Cl、Na2HPO4·12H2O、甘油磷酸鈉、EDTA與 Fe按摩爾比 1∶1配制、PII金屬液、Tris、KI, 各組分的相應(yīng)濃度為 3.5g/L、0.5g/L、0.5g/L、0.5g/L、0.025g/L、250ml/L、5g/L、0.001g/L, 該儲(chǔ)存液由蒸餾水配制, pH值調(diào)節(jié)為7.8。PII金屬液組分為, EDTA·2Na、FeCl3、H3BO3、MnCl2、ZnCl2、CoCl2, 各組分的相應(yīng)濃度為1g/L、0.01g/L、0.2g/L、0.04g/L、0.005g/L、0.001g/L, 該金屬液由超純水(Milli-Q Advantage 10, MILLIPORE)配制。消毒海水為經(jīng)沙濾及暗處理的自然海水煮沸消毒 20min,冷卻至常溫, 12h后再次煮沸消毒20min, 冷卻至常溫后即可用。

1.2 暫養(yǎng)條件下觀察雌、雄生殖細(xì)胞排放規(guī)律

觀察受精規(guī)律, 用量筒準(zhǔn)確量取 500mL已滅菌的 PESI培養(yǎng)液加入 500mL燒杯中, 培養(yǎng)液 pH值8.2±0.2, 實(shí)驗(yàn)過程中不更換培養(yǎng)液, 實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行組。用天平分別準(zhǔn)確稱取濕重 0.1g雌生殖托以及濕重 5g雄生殖托放入燒杯中, 由于生殖托會(huì)下沉,需要用聚乙烯繩將生殖托固定于水面以下 2—3cm。在溫度(25±0.5)°C、光照強(qiáng)度(3000±100)lx, 光照周期12h∶12h(L∶D)、鹽度 33±0.5條件下靜置培養(yǎng)生殖托, 第一批卵細(xì)胞排出后, 立即將雌生殖托移出, 并用培養(yǎng)液將卵細(xì)胞從生殖托上輕輕沖洗至直徑90mm培養(yǎng)皿中, 燒杯中的雄生殖托不被移出。隨后立即用一次性吸管吸取 100個(gè)卵細(xì)胞至原燒杯中, 每隔 1h用吸管將燒杯中所有的卵吸取至5個(gè)直徑90mm培養(yǎng)皿中, 每個(gè)皿中 20個(gè)卵, 皿中已加能完全浸沒卵的滅菌 PESI培養(yǎng)液, 并用吸管將卵分散以保證各卵不重疊。然后將每個(gè)培養(yǎng)皿均在ZEISS體視鏡下拍照3次, 拍攝畫面保證圖像清晰; 每次拍攝完成后, 將取出的卵吸取回原燒杯。在實(shí)驗(yàn)完成后選取清晰圖片并用photoshopCS6對(duì)圖片上的受精卵計(jì)數(shù), 記錄。受精率計(jì)算方法: R(%)=Nf·100%。其中, R為受精率(fertilization rates), Nf為記錄的受精卵數(shù)(fertilized eggs number)。根據(jù)已有馬尾藻早期發(fā)育相關(guān)文獻(xiàn)(張婧等, 2012; 賈檉等, 2012; 楊彬等, 2013; 趙素芬等,2013; 李健鵬等, 2014)以及觀察得出, 剛釋放出來的卵細(xì)胞具有8個(gè)分散的細(xì)胞核, 精子與卵中的一個(gè)細(xì)胞核結(jié)合后, 其余的細(xì)胞核逐漸與該核融合, 最終在細(xì)胞中央形成一個(gè)近似圓形的大細(xì)胞核, 標(biāo)志著受精過程完成, 受精卵已形成。受精卵形成后開始第一次分裂, 沿赤道板橫裂成2個(gè)細(xì)胞。隨后經(jīng)過多次橫、縱分裂, 形成了類似地雷狀的多細(xì)胞胚胎。隨后, 基部細(xì)胞橫裂形成囊泡狀細(xì)胞, 囊泡狀細(xì)胞繼續(xù)橫裂,逐漸伸長(zhǎng), 形成假根, 假根完全形成意味著已形成完整的幼孢子體; 此后幼孢子體迅速伸長(zhǎng)和發(fā)育。綜上,本文判定卵細(xì)胞和受精卵的依據(jù)為: 剛排出的8核細(xì)胞為卵細(xì)胞; 細(xì)胞處于受精過程中或者受精卵分裂過程中, 以及處于幼孢子體發(fā)育過程中, 均判定為“受精卵”。

觀察排放習(xí)性, 用量筒準(zhǔn)確量取 2L已滅菌的PESI培養(yǎng)液加入 2L燒杯中, 培養(yǎng)液 pH值 8.2±0.2,實(shí)驗(yàn)過程中不更換培養(yǎng)液, 實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行組。將取下的雌、雄生殖托用天平分別準(zhǔn)確稱取不同濕重(0.5, 1, 2, 4, 8g), 將等重量的雌、雄生殖托放入同一燒杯中。用聚乙烯繩將生殖托固定于水面以下 2—3cm, 在室內(nèi)靜置暫養(yǎng)條件下培養(yǎng)生殖托。當(dāng)每個(gè)光周期或暗周期結(jié)束時(shí)以及結(jié)束后6h時(shí), 在 90mm培養(yǎng)皿中加入能完全浸沒卵的滅菌 PESI培養(yǎng)液后, 用鑷子在燒杯中隨機(jī)取 10個(gè)雌生殖托至培養(yǎng)皿中; 并用電子天平上稱量放入生殖托前后培養(yǎng)皿的重量,前后的重量差即為取樣生殖托的重量。由于雌生殖托呈三棱形, 將其三個(gè)面在體視鏡下各拍照3次; 同時(shí)用玻璃棒攪拌均勻燒杯中的培養(yǎng)液, 然后用吸管隨機(jī)吸取培養(yǎng)液至10mL量筒中定容5mL, 定容后將量筒中的卵吸出至培養(yǎng)皿中, 向每個(gè)培養(yǎng)皿吸入若干卵并用吸管將卵分散以保證各卵不重疊, 在吸入卵之前皿中已加能完全浸沒卵的滅菌PESI培養(yǎng)液。每個(gè)培養(yǎng)皿均在體視鏡下拍照 3次, 每次拍攝完成后,將取出的雌生殖托、卵、培養(yǎng)液均放回原燒杯, 在實(shí)驗(yàn)完成后選取清晰圖片并用 photoshopCS6對(duì)圖片上的受精卵、未受精卵計(jì)數(shù), 記錄, 并計(jì)算出排卵量、總受精卵量、脫落的受精卵量。計(jì)算方法:

NR(個(gè)/g)=[400× (N1+N2)+M1/M2× (M3+M4)]/M1;

NZ(個(gè)/g)=(400×N1+M1/M2×M3)/M1;

NE(個(gè)/g)=400× (N1+N2)/M1。

其中, NR為排卵量(released eggs number), NZ為總受精卵量(zygotes number), NE為脫落的受精卵量(exutive zygotes number), N1為水樣中的受精卵量, N2為水樣中的未受精卵量, M1為實(shí)驗(yàn)生殖托重量, M2為取樣生殖托重量, M3為取樣生殖托上的受精卵量, M4為取樣生殖托上的未受精卵量。

1.3 溫度、鹽度及水流速度對(duì)全緣馬尾藻生殖細(xì)胞排放的影響

溫度實(shí)驗(yàn), 溫度設(shè)置25, 27, 29, 31, 33°C五個(gè)梯度, 其他條件為光照周期 0h∶24h(L∶D), 鹽度 33,pH值8.2, 靜置培養(yǎng)。鹽度實(shí)驗(yàn), 鹽度設(shè)置29, 31, 33,35, 37五個(gè)梯度, 其它條件為光照周期 0h∶24h(L∶D), 溫度 29°C, pH值 8.2, 靜置培養(yǎng)。流速實(shí)驗(yàn), 水流速度實(shí)驗(yàn)設(shè)置0, 3, 6, 9, 12cm/s五個(gè)梯度, 其他條件為光照周期 0h∶24h(L∶D), 溫度 29°C, 鹽度 33,pH值8.2。在單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行促排正交實(shí)驗(yàn), 正交設(shè)計(jì)采用34實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì), 其他條件為光照周期0h∶24h(L∶D), pH值8.2。

溫度使用光照培養(yǎng)箱控制; 光照由光照培養(yǎng)箱提供, 并用分體式照度計(jì)測(cè)定; 鹽度使用海水精鹽和超純水調(diào)節(jié), 采用便攜式鹽度計(jì)測(cè)定; 水流速度由氣石充氣提供, 將氣石固定在與生殖托同一水層面, 通過控制氣流大小調(diào)整水流速度, 水流速度采用便攜式流速測(cè)定儀測(cè)定, 保證生殖托所在水層面的水流速度。由于水流速度小, 燒杯下層流速近于 0, 脫落的卵細(xì)胞和受精卵會(huì)逐漸沉降在燒杯底部。

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組量取2L已滅菌的PESI培養(yǎng)液至2L大燒杯中, 培養(yǎng)液pH值8.2, 實(shí)驗(yàn)過程中培養(yǎng)液不更換, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行組。每個(gè)燒杯中放入2g等重量的雌、雄生殖托, 用聚乙烯繩將生殖托固定于水面以下 2—3cm。實(shí)驗(yàn)在上述實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行, 實(shí)驗(yàn)開始后定時(shí)取杯中的雌生殖托在體視鏡下觀察,判斷排卵結(jié)束的時(shí)間并記錄。在排卵結(jié)束時(shí)以及排卵結(jié)束后6h時(shí)取杯中的雌生殖托以及攪拌均勻的培養(yǎng)液, 將二者在體視鏡下快速拍照, 并利用圖片計(jì)算排卵量、總受精卵量、脫落的受精卵量, 具體方法如觀察排卵習(xí)性時(shí)所用方法。

1.4 雌、雄生殖托的比例對(duì)生殖細(xì)胞排放的影響

雌、雄生殖托的重量比值設(shè)置 1∶1(2g∶2g),1∶2 (2g∶4g), 1∶4(2g∶8g), 1∶6(2g∶12g), 1∶8(2g∶16g)五個(gè)梯度。在溫度 31°C, 鹽度 33±1, 水流速度(6±1)cm/s, 光照周期 0h∶24h(L∶D)的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組量取2L已滅菌的PESI培養(yǎng)液至2L大燒杯中, 培養(yǎng)液pH值8.2, 實(shí)驗(yàn)過程中培養(yǎng)液不更換, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行組。然后將雌、雄生殖托按比例放入燒杯中, 用聚乙烯繩將生殖托固定于水面以下 2—3cm。實(shí)驗(yàn)開始后, 定時(shí)取杯中的雌生殖托在體視鏡下觀察, 判斷排卵結(jié)束的時(shí)間并記錄。在排卵結(jié)束時(shí)以及排卵結(jié)束后6h時(shí)取杯中的雌生殖托以及攪拌均勻的培養(yǎng)液, 將二者在體視鏡下快速拍照, 并利用圖片計(jì)算排卵量、總受精卵量、脫落的受精卵量, 具體方法如觀察排卵習(xí)性時(shí)所用方法。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用 SPSS18.0進(jìn)行處理, 結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)比較采用方差分析和 Tukey多重比較法, 以 P＜0.05作為顯著差異, 并用Origin8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵細(xì)胞的受精率與排出時(shí)間的關(guān)系

當(dāng)卵細(xì)胞排出后(見圖1b), 在雄生殖托(見圖1c)排出精細(xì)胞足夠量的條件下受精。由圖 2可以得出,卵細(xì)胞排出1h后, 受精率為(63±3.06)%, 隨著時(shí)間的延長(zhǎng), 卵細(xì)胞的受精率逐漸升高, 且前 3h之間的受精率差異明顯(P＜0.05)。受精率在 4h達(dá)到最大值(89.7±0.6)%, 受精率在 4h后不再升高, 其原因可能是: 在 4h內(nèi)無有活性的精子與排出的卵細(xì)胞結(jié)合,卵細(xì)胞將會(huì)凋亡。結(jié)果表明, 排出的卵細(xì)胞在 4h內(nèi)具有活性, 能夠受精。

圖1 全緣馬尾藻的雄生殖托及受精前、后的雌生殖托Fig.1 The receptacles of male Sargassum integerrimum and the female one before and after fertilization注: 字符1為剛排出的卵細(xì)胞; 2為受精卵, 已開始分裂; 3為未受精的卵細(xì)胞, 已死亡。子圖a和b為雌生殖托, c為雄生殖托。圖中標(biāo)尺均為1mm

圖2 全緣馬尾藻排卵以后受精率的變化Fig.2 Variation in fertilization rate of S. integerrimum after ovulation注: 誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差, 組間不同字母表示差異顯著

2.2 在室內(nèi)暫養(yǎng)條件下雌、雄生殖細(xì)胞的排放規(guī)律

在室內(nèi)暫養(yǎng)條件下暫養(yǎng)約 5d后, 雌生殖托開始排卵。從圖3可以發(fā)現(xiàn), 雌生殖托排放卵細(xì)胞主要在黑暗條件下完成。完成整個(gè)排卵過程約需 3d。第 1d的排卵量最多, 為(8473±1065)個(gè)/g, 后 2d的排卵量逐漸減少。3d內(nèi)卵細(xì)胞的總排放量可以達(dá)到(14431±1288)個(gè)/g。由于排出的卵細(xì)胞在4h內(nèi)能完成受精, 研究在每個(gè)光周期或暗周期結(jié)束后拍照記錄用以計(jì)算排卵量, 6h再次拍照記錄用以計(jì)算受精卵量以及脫落的受精卵量。對(duì)比圖3與圖4, 發(fā)現(xiàn)受精卵量隨卵細(xì)胞排出量變化而改變, 且二者數(shù)量的變化時(shí)間相對(duì)一致, 這從側(cè)面說明雄生殖托排放精子與雌生殖托排放卵細(xì)胞基本同步。整個(gè)排卵過程的受精率為50%—60%, 最終得到的受精卵量為(8358±734)個(gè)/g。

受精完成后, 受精卵如圖1a“掛卵”, 只有部分受精卵脫落。從圖5中可看出在42h內(nèi)的脫落受精卵量很低, 直到48h才開始大量脫落, 72h內(nèi)的總脫落的受精卵量為(4283±272)個(gè)/g。與排卵過程相似, 受精卵的脫落過程也主要集中在黑暗條件下。72h內(nèi)總排卵量除去脫落受精卵量得到掛卵量約為 10000個(gè)/g,接近48h內(nèi)的排卵量, 這表明卵脫落的原因可能是雌生殖托表面積有限, 新排出的卵細(xì)胞導(dǎo)致“掛卵”脫落。由此可以推測(cè), 在靜置條件下, 脫落受精卵量主要與排卵量相關(guān)。

2.3 雌生殖托的排卵量與其重量的關(guān)系

將表 1中的雌生殖托(見圖 1)總排卵量與雌生殖托重量進(jìn)行一元線性回歸分析, 二者回歸關(guān)系極其顯著, 符合回歸方程?y= –3080.875+17295.056x, 判定系數(shù) R2=0.99。同時(shí)對(duì)二者進(jìn)行相關(guān)分析, 得到相關(guān)性系數(shù)r=0.99, 說明雌生殖托的總排卵量與雌生殖托的重量呈正相關(guān), 且相關(guān)極其顯著。在實(shí)際應(yīng)用中可以依據(jù)雌生殖托的重量估算其總排卵量。

2.4 溫度、鹽度及水流速度對(duì)全緣馬尾藻生殖細(xì)胞排放的影響

從表2可得出, 改變溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)組所需促排時(shí)間影響較大。29°C組促排需要的時(shí)間最長(zhǎng), 33°C組所需促排時(shí)間最短。當(dāng)溫度高于或低于 29°C時(shí), 各實(shí)驗(yàn)組需要的促排時(shí)間都逐漸減少, 且差異顯著(P＜0.05)。隨著溫度改變, 排卵時(shí)間變化與促排時(shí)間變化相一致。改變鹽度對(duì)實(shí)驗(yàn)組所需促排時(shí)間影響也較大。鹽度33組所需促排時(shí)間最長(zhǎng), 29組所需促排時(shí)間最短。當(dāng)鹽度高于或低于 33時(shí), 各實(shí)驗(yàn)組需要的促排時(shí)間逐漸減少, 且差異顯著(P＜0.05)。隨著鹽度改變, 各實(shí)驗(yàn)組的排卵時(shí)間變化與促排時(shí)間變化相一致。相比于溫度和鹽度, 改變水流速度對(duì)實(shí)驗(yàn)組促排時(shí)間影響較小。0cm/s組需要的促排時(shí)間最長(zhǎng),12cm/s組所需促排時(shí)間最短。當(dāng)水流速度高于0cm/s時(shí), 需要的促排時(shí)間逐漸減少, 除 3和 6cm/s組外,各實(shí)驗(yàn)組的促排時(shí)間差異顯著(P＜0.05), 其他各實(shí)驗(yàn)組需要的促排時(shí)間差異顯著(P＜0.05)。隨著水流速度改變, 排卵時(shí)間變化與促排時(shí)間變化相一致。

圖3 全緣馬尾藻的排卵量Fig.3 The amount of S. integerrimum eggs released注: 誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差

圖4 全緣馬尾藻的受精卵量Fig.4 The amount of S. integerrimum zygotes that fertilized注: 誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差

圖5 全緣馬尾藻排卵以后的脫落受精卵量Fig.5 The amounts of exutive eggs of S. integerrimum after eggs release注: 誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差

表1 雌生殖托的重量與其排卵量的關(guān)系Tab.1 Relationship between the weight of female receptacles and the capacity of its reproduction

從圖6可得, 溫度改變對(duì)雌生殖托的排卵量影響相對(duì)較小, 除33°C組外, 其他4組的排卵量差異不顯著(P＞0.05)。33°C 組的排卵量最少, 為(6422±670)個(gè)/g。27°C 組、29°C 組、31°C 組的受精卵量最高(P＞0.05)。當(dāng)溫度過高(33°C)或者過低(25°C)時(shí), 實(shí)驗(yàn)組的受精卵量明顯減少, 與其他三組相比差異顯著(P＜0.05)。33°C組的受精卵量最低, 為3048±338個(gè)/g。各實(shí)驗(yàn)組的脫落受精卵量與排卵量都成呈正相關(guān),除 33°C組外, 各組的脫落受精卵量差異不顯著(P＞0.05)。33°C 組脫落受精卵量最少, 為(334±183)個(gè)/g。分析可得, 溫度在27—31°C間時(shí)得到的受精卵以及脫落受精卵最多。

圖7顯示, 改變鹽度對(duì)雌生殖托的排卵量影響較大。鹽度 29組的排卵量最少, 為(4214±253)個(gè)/g, 與其他 4組差異顯著(P＜0.05)。隨著鹽度的升高, 排卵量明顯增加, 33組以及 35組的排卵量達(dá)到最多(P＞0.05)。當(dāng)鹽度高于33時(shí), 排卵量逐漸下降; 鹽度越高, 排卵量下降越明顯。37組的排卵量與31組的排卵量相近(P＞0.05)。但 35組的受精卵量最高, 為(10450±1214)個(gè)/g。除33組外, 各實(shí)驗(yàn)組的受精卵量與排卵量成正相關(guān), 29組受精量最低, 為(1037±206)個(gè)/g。各實(shí)驗(yàn)組的脫落受精卵量與排卵量成正相關(guān),且33、35、37組的脫落受精卵量差異顯著(P＜0.05), 可見鹽度比溫度對(duì)脫落受精卵量的影響更明顯。33組的脫落受精卵量最多, 為(3333±376)個(gè)/g; 29組的脫落受精卵量最少, 為(366±136)個(gè)/g。鹽度過高或者過低時(shí)受精卵量明顯減少, 所以將鹽度控制在 35左右可使形成的受精卵量最多; 但是在實(shí)際生產(chǎn)中只能收集到脫落的受精卵, 所以鹽度控制在 33左右可收集到的受精卵最多。

表2 改變環(huán)境因子對(duì)促排時(shí)間和排卵時(shí)間的影響Tab.2 Changes in decorporation time and ovulation time under different environmental condition

圖6 改變溫度對(duì)全緣馬尾藻的排卵量、受精卵量、脫落受精卵量的影響Fig.6 Variations of gamete released, zygotes, and exutive eggs of S. integerrimum with temperature注: 誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差

圖7 改變鹽度對(duì)全緣馬尾藻的排卵量、受精卵量、脫落受精卵量的影響Fig.7 Variations of gamete released, zygotes, and exutive eggs of S. integerrimum with salinity注: 誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差

從圖8可得, 當(dāng)水流速度從0cm/s升高至6cm/s,雌生殖托的排卵量逐漸增多, 3和 6cm/s組的排卵量為最多(P＞0.05), 二者與 0cm/s組的排卵量差異顯著(P＜0.05)。隨著水流速度加快, 排卵量開始下降, 流速越高, 下降越明顯。9cm/s組的排卵量下降至與0cm/s組相近(P＞0.05)。12cm/s組的排卵量最少, 與其他 4組均差異顯著(P＜0.05), 為(8412±772)個(gè)/g。受精卵量與排卵量成正相關(guān), 12cm/s組的受精卵量最低, 為(1548±231)個(gè)/g, 6cm/s組的受精卵量最高, 為(11339±1170)個(gè)/g。脫落受精卵量與水流速度變化基本相一致,水流速度越多, 受精卵量的脫落率越高, 0、3和6cm/s組脫落受精卵量差異顯著(P＜0.05), 6cm/s組的脫落受精卵量最高, 為(8044±644)個(gè)/g; 但當(dāng)水流速度高于6cm/s時(shí), 由于卵量影響, 脫落受精卵量逐漸減少(P＜0.05), 12cm/s組的脫落受精卵量最少, 為(1468±222)個(gè)/g。水流過高或過低都不利于增加受精卵量,所以將水流控制在6cm/s左右可使形成的受精卵量最多, 且在實(shí)際生產(chǎn)中只能收集到脫落的受精卵, 所以鹽度控制在6cm/s左右可收集到的受精卵最多。

圖8 改變水流速度對(duì)全緣馬尾藻的排卵量、受精卵量、脫落受精卵量的影響Fig.8 Variations of gamete released, zygotes, and exutive eggs of S. integerrimum with flow speed注: 誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差

2.5 生殖細(xì)胞排放過程中溫度、鹽度、水流速度條件的優(yōu)化

對(duì)表 3中的脫落受精卵量進(jìn)行一般線性模型分析, 得到單因素統(tǒng)計(jì)量Kn值。三種不同溫度對(duì)應(yīng)的K值間差異不顯著(P＞0.05), 說明溫度對(duì)脫落受精卵量影響不顯著; 三種不同鹽度對(duì)應(yīng)的 K值間差異不顯著(P＞0.05), 說明鹽度對(duì)脫落受精卵量影響不顯著;三種不同水流速度對(duì)應(yīng)的K值間差異不明顯(P＞0.05),說明水流速度對(duì)脫落受精卵量影響不顯著。所以, 在溫度為(29±2)°C, 鹽度為 33±1, 水流速度為(6±1)cm/s的條件下對(duì)生殖細(xì)胞促排, 實(shí)驗(yàn)組得到的脫落受精卵量最多。

排卵時(shí)間變化與促排時(shí)間的變化呈正相關(guān), 所以僅對(duì)促排時(shí)間分析, 得到單因素統(tǒng)計(jì)量Kn值見表2—3。三種不同溫度對(duì)應(yīng)的K值間差異顯著(P＜0.05),說明溫度對(duì)所需促排時(shí)間影響顯著; 三種不同鹽度對(duì)應(yīng)的K值間差異不顯著(P＞0.05), 說明鹽度對(duì)所需促排時(shí)間影響不顯著; 三種不同水流速度對(duì)應(yīng)的 K值間差異不明顯(P＞0.05), 說明水流速度對(duì)所需促排時(shí)間影響不顯著。比較溫度的 Kn值, 當(dāng)溫度為 31°C時(shí)對(duì)應(yīng)的K值最小, K值越小, 表明此因素在該水平下所需促排時(shí)間最短。所以, 在溫度為31°C, 鹽度為33±1, 水流速度為(6±1)cm/s的條件下對(duì)生殖細(xì)胞促排, 實(shí)驗(yàn)組所需促排時(shí)間以及排卵時(shí)間最短。

綜上分析, 在溫度為 31°C, 鹽度為 33±1, 水流速度為(6±1)cm/s的條件下, 實(shí)驗(yàn)組得到的受精卵量最多, 且所需促排和排卵時(shí)間最短, 該條件為最適促排條件。

表3 促排實(shí)驗(yàn)正交設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.3 Orthogonal design and results for decorporation experiments

2.6 提高雌、雄生殖托重量比對(duì)生殖細(xì)胞排放及受精率的影響

從表4中可以得出, 雌、雄生殖托的重量比對(duì)促排時(shí)間的影響較大, 各實(shí)驗(yàn)組所需促排時(shí)間差異顯著(P＜0.05)。隨著雌、雄生殖托重量比的降低, 各實(shí)驗(yàn)組所需促排時(shí)間逐漸減少。當(dāng)雌、雄生殖托重量比為 1∶6時(shí)所需促排時(shí)間最少, 比暫養(yǎng)條件下所需促排時(shí)間縮短了4d。當(dāng)雌、雄生殖托重量比低于1∶6時(shí), 所需促排時(shí)間不再減少。雌、雄生殖托的比例對(duì)排卵時(shí)間的影響不大, 隨著雌、雄生殖托重量比的降低,各實(shí)驗(yàn)組的排卵時(shí)間逐漸減少。除1∶6以及1∶8兩組外, 其他各組的排卵時(shí)間差異不顯著(P＞0.05)。當(dāng)雌、雄生殖托重量比為 1∶6時(shí)所需排卵時(shí)間最少, 排卵時(shí)間比暫養(yǎng)條件下的排卵時(shí)間縮短了 2d。當(dāng)雌、雄生殖托重量比低于 1∶6時(shí), 排卵時(shí)間不再減少。在最適條件下, 雌、雄生殖托重量比對(duì)受精率的影響不大。隨著雌、雄生殖托重量比降低, 受精率逐漸升高, 當(dāng)雌、雄生殖托重量比低于 1∶2時(shí), 各組之間的受精率差異不明顯(P＞0.05)。雌、雄生殖托重量比為 1∶6時(shí)受精率達(dá)到最高, 為(94.4± 0.3)%。

表4 不同生殖托比例對(duì)生殖細(xì)胞排放的影響Tab.4 The effect on discharging gametes for changing ratios of female and male receptacles

3 討論

3.1 全緣馬尾藻生殖細(xì)胞的排放規(guī)律

在觀察中發(fā)現(xiàn), 全緣馬尾藻生殖細(xì)胞排放集中在凌晨2點(diǎn)—4點(diǎn)完成, 具有夜間排放習(xí)性。與全緣馬尾藻同屬馬尾藻科的羊棲菜也具有這一習(xí)性(Zou et al, 2005)。此外, 巖藻(Fucus ceranoides)與全緣馬尾藻同屬墨角藻目, 其生殖細(xì)胞排放習(xí)性也為夜間排放(Brawley, 1992)。其原因可能是物種在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中對(duì)環(huán)境的適應(yīng)。黑暗條件有利于生殖細(xì)胞的存活, 剛排放出來生殖細(xì)胞不能進(jìn)行光合作用, 沒有光照的要求; 如果光照過強(qiáng), 生殖細(xì)胞以及受精卵會(huì)因?yàn)楣獯碳ざ艿揭欢ǔ潭葥p傷。其次, 自然海區(qū)凌晨的溫度較低, 有利于提高生殖細(xì)胞以及受精卵的存活率。受精卵的“掛卵”特點(diǎn)也可能是全緣馬尾藻為適應(yīng)環(huán)境而形成的防御特性。自然海區(qū)的風(fēng)浪較大,“掛卵”有利于受精卵的萌發(fā)和生長(zhǎng)。而部分受精卵脫落的根本原因可能是由于雌生殖托的表面積有限從而藻體產(chǎn)生的一種繁殖策略。附著能力低的受精卵由于生存能力低將會(huì)脫落, 雌生殖托自身會(huì)再形成新的受精卵代替這些脫落的受精卵, 這種現(xiàn)象屬于MacArthur提出的 r—選擇繁殖策略。導(dǎo)致受精卵脫落的主要直接原因可能是雌生殖托通過自身調(diào)節(jié)減少表面黏性或者分泌物質(zhì)消解受精卵的黏性分泌物。其次, 新排出的卵細(xì)胞產(chǎn)生的物理張力也會(huì)加快受精卵脫落。當(dāng)馬尾藻受到環(huán)境改變帶來的威脅時(shí)會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)提前進(jìn)行生殖行為(Agrawal, 2012)。本研究小范圍改變溫度、鹽度等非生物因素和生物因素都縮短其促排時(shí)間和排卵時(shí)間, 說明全緣馬尾藻的生物應(yīng)激性較強(qiáng), 這一特點(diǎn)也是全緣馬尾藻適應(yīng)多變的海洋環(huán)境的體現(xiàn)。本研究中全緣馬尾藻排出的卵細(xì)胞在4h內(nèi)具有受精活性。巖藻和羊棲菜與全緣馬尾藻同屬墨角藻目, 二者的卵細(xì)胞排出后分別在 2h內(nèi)和6h內(nèi)具有活性( Brawley, 1992; Pang et al, 2006);而全緣馬尾藻同屬馬尾藻屬的銅藻, 其卵細(xì)胞排出后在48h內(nèi)具有受精能力(Pang et al, 2009)。比較說明全緣馬尾藻的自然繁殖能力在馬尾藻屬中相對(duì)較弱, 從而其雌、雄生殖細(xì)胞排放的同步性對(duì)其卵細(xì)胞的受精率尤其重要。

生物信息素為雌、雄生殖托排放的外激素, 為植物間傳遞信號(hào)的化學(xué)物質(zhì), 在褐藻門植物的雌、雄生殖托的分化、成熟以及生殖細(xì)胞排放過程中都有重要的作用, 各種藻體產(chǎn)生的信息素所含化學(xué)物質(zhì)的種類也不同, 但均源于不飽和脂肪酸。如信息素可首先誘導(dǎo)雄性生殖囊排放精子, 精子排放后有利于雌、雄植株同步排放, 同時(shí)也有利于誘導(dǎo)雌性植株排放雌性信息素(Pantke-B?cker et al, 1995)。在生殖細(xì)胞排放之前, 生物信息素能誘導(dǎo)生殖托分化, 增強(qiáng)生殖托對(duì)強(qiáng)光照的適應(yīng)能力, 進(jìn)而促進(jìn)生殖托成熟。如雄性生殖托較少, 雄性生殖托產(chǎn)生的生物信息素會(huì)使雌性生殖托的趨光性減弱, 導(dǎo)致成熟的雌性生殖托個(gè)體較小, 說明生物信息素誘導(dǎo)雌、雄生殖托的同步成熟(Togashi et al, 2004)。生殖托成熟后, 雄生殖托產(chǎn)生的生物信息素與雌生殖托細(xì)胞表面的受體結(jié)合后,經(jīng)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)后作用于細(xì)胞結(jié)構(gòu), 促使卵細(xì)胞排放, 其作用強(qiáng)度決定了雌、雄生殖細(xì)胞排放的同步性。此前, Pang等(2005)研究發(fā)現(xiàn)羊棲菜雌、雄生殖細(xì)胞排放不完全同步, 但在其研究中通過改變環(huán)境條件使生殖細(xì)胞完全同步排放后, 羊棲菜卵細(xì)胞的受精率可高達(dá)90%。本研究中, 暫養(yǎng)條件下卵細(xì)胞的受精率50%—60%, 說明其信息素誘導(dǎo)的排放并不完全同步。

3.2 溫度、鹽度對(duì)生殖細(xì)胞排放及受精過程的影響

王增福等(2007)研究發(fā)現(xiàn), 在成熟時(shí)的溫度的基礎(chǔ)上, 升高溫度有利于生殖細(xì)胞的排放。本研究結(jié)果顯示, 促排溫度為 29°C時(shí)全緣馬尾藻促排所需時(shí)間最長(zhǎng), 溫度升高或者降低均使促排所需時(shí)間明顯減少, 其原因可能為: 29°C為全緣馬尾藻卵細(xì)胞形成的最適宜溫度, 在此溫度下已成熟的卵細(xì)胞排放最為穩(wěn)定, 促排所需時(shí)間最長(zhǎng); 溫度升高或者降低會(huì)對(duì)卵細(xì)胞產(chǎn)生刺激, 產(chǎn)生一系列的生理變化, 從而使卵細(xì)胞提前排放。溫度對(duì)排卵量的影響不大, 溫度25—31°C時(shí)雌生殖托的排卵量相差不大, 溫度高于31°C時(shí)排卵量明顯減少, 這可能是由于溫度過高導(dǎo)致卵細(xì)胞活性下降甚至衰亡, 從而使排出的卵細(xì)胞減少。溫度 27—31°C時(shí)得到的受精卵量最多, 且受精率最高, 而當(dāng)溫度高于31°C或者低于25°C時(shí), 得到的受精卵量顯著減少以及受精率都明顯下降, 其原因可能是溫度 27—31°C時(shí)信息素信號(hào)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)所需酶的活性最高, 從而提高了雌、雄生殖細(xì)胞排放的同步性。促排鹽度為33時(shí)全緣馬尾藻促排所需時(shí)間最長(zhǎng), 鹽度升高或者降低均使促排所需時(shí)間明顯減少, 其原因可能為: 全緣馬尾藻卵細(xì)胞形成的最適宜鹽度為 33, 在此鹽度下已成熟的卵細(xì)胞排放最穩(wěn)定,促排所需時(shí)間最長(zhǎng), 鹽度升高或者降低會(huì)對(duì)卵細(xì)胞產(chǎn)生刺激, 產(chǎn)生一系列的生理變化, 從而使卵細(xì)胞提前排放。本研究中, 鹽度為33—35時(shí)排卵量最大, 當(dāng)鹽度升高或下降時(shí)排卵量都呈下降趨勢(shì), 這可能是細(xì)胞外鹽度改變引起細(xì)胞內(nèi)滲透壓過高或者過低,從而導(dǎo)致卵細(xì)胞大量衰亡(Agrawal, 2012)。溫度對(duì)受精卵的脫落過程基本無影響, 而鹽度對(duì)受精卵的脫落過程有一定的影響, 在鹽度為 35時(shí)不利于受精卵的脫落, 這可能是由于此鹽度條件下, 受精卵表層分泌的的黏性物質(zhì)較處于其他鹽度時(shí)增多, 具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

墨角藻目海藻的卵細(xì)胞受精方式多為體外受精。與人類等高等生物相似, 其卵細(xì)胞的細(xì)胞膜上具有Na+依賴性通道, 可以控制精子進(jìn)入。在一個(gè)精子進(jìn)入卵細(xì)胞后, 通道暫時(shí)關(guān)閉, 可以防止其他精子進(jìn)入而造成多精受精。多精受精卵不能正常分裂, 容易死亡。但是隨著海水鹽度的大幅度改變, 滲透作用使細(xì)胞內(nèi)的 Na+濃度水平不穩(wěn)定, Na+依賴性通道的保護(hù)功能受到破壞, 從而使產(chǎn)生多精受精卵的概率增大(Brawley, 1992)。本研究結(jié)果表明鹽度在35時(shí)的受精率最高, 說明全緣馬尾藻卵細(xì)胞的 Na+依賴性通道在鹽度35時(shí)更具穩(wěn)定性。另外, Na+依賴性通道進(jìn)行正常生理活動(dòng)需要能量, 所以溫度會(huì)通過影響產(chǎn)能所需酶的活性進(jìn)而影響受精率。參考已有的海洋表面溫度(SST)數(shù)據(jù), 5月份我國(guó)南海海區(qū)表層海水的平均溫度在 29°C 左右(湯超蓮, 2008; Wang et al, 2012), 推測(cè)溫度在29°C左右時(shí)產(chǎn)能所需酶的活性最高, 能較好地維持 Na+依賴性通道的保護(hù)功能。所以試驗(yàn)得出溫度(29±2)°C 的得到的受精卵量最多, 該結(jié)果比較合理。

3.3 水流速度及雌、雄生殖托比例對(duì)生殖細(xì)胞排放及受精過程的影響

Togashi等(2008)的研究發(fā)現(xiàn)自然狀態(tài)下雄生殖托排放的精子數(shù)目遠(yuǎn)多于雌生殖托排放的卵細(xì)胞數(shù)目, 卵細(xì)胞的受精率與精子數(shù)目無明顯相關(guān)性。而本研究中增加雄生殖托的比例能夠提高受精率, 縮短促排時(shí)間, 其原因可能是雄生殖托釋放的雄性信息素濃度隨著雄生殖托數(shù)量增多而升高。高濃度的信息素使排卵過程提前, 并使排卵過程與精子排放過程的同步性增強(qiáng)。適當(dāng)增加水流速度可以使雌、雄信息素在雌、雄生殖托之間充分傳遞(Pearson et al, 2006)。本研究將水流速度升至6cm/s時(shí), 排卵量以及受精率都達(dá)到最高。而當(dāng)水流速度高于6cm/s時(shí), 排卵量以及卵細(xì)胞的受精率都明顯下降, 其原因可能是水流速度過高導(dǎo)致信息素的稀釋倍數(shù)過大, 從而雄性生物信息素對(duì)雌性生殖托的作用減弱, 以致排卵量減少及排卵過程滯后。Ladah等(2008)的研究也證明了這一點(diǎn), 在自然海區(qū), 墨角目海藻一般在水流緩慢的退潮期排放生殖細(xì)胞, 生物信息素能充分傳遞但不會(huì)被大量稀釋, 能高效作用于生殖托并誘導(dǎo)生殖細(xì)胞排放。但Zou等(2005)在研究羊棲菜排放規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn), 靜置處理組的排卵量比流水處理組的排卵量高,其原因可能為其雄生殖托釋放的信息素在水流作用下被稀釋。此外, 研究結(jié)果也表明脫落卵量與水流速度成正相關(guān)。目前馬尾藻人工育苗中幼孢子體附著率極低, 對(duì)采苗量影響極大, Zhang等(2012)的研究表明鼠尾藻在育苗過程中的自然附著率在 10%以下, 而本研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)提高水流速度可加快受精卵脫落,進(jìn)而提高附著率, 可增加人工育苗過程中的采苗量。在暫養(yǎng)條件基礎(chǔ)上, 改變溫度、鹽度、水流速度及雌、雄生殖托比例后, 卵細(xì)胞的受精率可達(dá)到(94.4±0.3)%, 具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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