趙本宣 趙 晟 李汝偉 劉 強(qiáng) 吳常文①

(1. 浙江海洋大學(xué) 舟山 316022; 2. 國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 舟山 316022)

大洋海域更具生存優(yōu)勢, 這意味著AAPB的豐度和多樣性會隨環(huán)境中營養(yǎng)豐富程度的提高而降低, 反之亦然。而Goericke(2002)等在南加利福尼亞沿岸的富營養(yǎng)、中營養(yǎng)和貧營養(yǎng)水域的對比研究卻得出與Kolber等人相反的結(jié)論。有人在泥炭沼澤湖泊中研究發(fā)現(xiàn), 在 pH為 6.7—7.6之間時, AAPB的豐度最高(Lew et al, 2016)。因此, 目前AAPB在初級生產(chǎn)力中的地位還不能夠完全明確, 而且影響AAPB分布格局及其在海洋生物生產(chǎn)和物質(zhì)循環(huán)中生態(tài)地位的機(jī)制或許要比預(yù)期的更加復(fù)雜(胡耀華, 2006), 只有從季節(jié)、年度尺度上對全球多個典型海區(qū)的廣泛的自然生態(tài)學(xué)調(diào)查, 獲取更充分、更具代表性的第一手?jǐn)?shù)據(jù),才能全面、準(zhǔn)確地評估AAPB在海洋中的生態(tài)地位。

基于基因組和其它單基因位點(diǎn)的證據(jù)表明,AAPB和厭氧光合細(xì)菌一樣也含有細(xì)菌葉綠素, 它們是按功能分類的一類屬于變形菌門的細(xì)菌(Yurkov et al, 1998a, b; Bryant et al, 2006)。早期發(fā)現(xiàn)的大部分AAPB都來源于海洋環(huán)境, 在進(jìn)化上都屬于α-Proteobacteria, 而 唯 一 屬 于 β-Proteobacteria的AAPB來自于淡水環(huán)境(Suyama et al, 1999), 基于環(huán)境序列的分析表明海洋未可培養(yǎng)細(xì)菌中還存在著類似 β-Proteobacteria 的 AAPB (Béjà et al, 2002)。而最近的研究表明在近岸海洋表層微生物群落中γ-Proteobacteria也占有相當(dāng)?shù)谋戎?Hu et al, 2006;Cho et al, 2007)。基于可培養(yǎng)和非培養(yǎng)的研究表明AAPB具有屬于α、β、γ分支的廣泛的遺傳多樣性, 這些研究都擴(kuò)展了AAPB的多樣性(Salka et al, 2008)。由于海洋環(huán)境中絕大多數(shù)細(xì)菌都是未可培養(yǎng)的, 必然還會存在許多稀有的、目前還不為人知的AAPB種類。前人研究表明, 基于 16S rRNA的基因序列與pufM基因的序列分析結(jié)果所得到的AAPB系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系不完全一致, 這說明光合作用的超級操縱子的側(cè)向遷移產(chǎn)生了高度多樣化的 AAPB 群落(Nagashima et al, 1997; Yurkov et al, 1998a, b)。像 16S rRNA基因, pufM基因存在于所有的AAPB中, 具有保守區(qū)和可變區(qū), 使其成為一個很好的用于量化的豐度和評估 AAPB 的遺傳多樣性的分子標(biāo)記(Achenbach et al, 2001; Allgaier et al, 2003)。由編碼光合反應(yīng)中心M亞基的pufM基因所設(shè)計出來的引物被廣泛地用來擴(kuò)增來自不同環(huán)境的樣品, 作為研究AAPB基因多樣性的最常用的方法(Yutin et al, 2005)。

對整個大西洋和太平洋的觀測證據(jù)表明, AAPB的豐度和多樣性沿環(huán)境梯度而改變。例如, 沿海和咸水似乎具有獨(dú)特的AAPB分支, 而在開放的海洋中卻未發(fā)現(xiàn)(Yutin et al, 2007)。同樣, 具有更高生產(chǎn)力的水域, 正如高葉綠素 a濃度所指示的, AAPB多樣性比貧營養(yǎng)水域要低(Jiao et al, 2007)。相反, 在一些主要的出海口定的采樣位置自由生活與顆粒附著AAPB之間不存在顯著差異, 但采樣點(diǎn)之間卻存在遺傳多樣性的顯著差異(Cottrell et al, 2010)。來自波羅的海不同位置的細(xì)菌樣本間存在 AAPB實質(zhì)性的遺傳變異, 包括兩個淡水和咸水分支(Masín et al, 2006;Salka et al, 2008), 進(jìn)一步表明AAPB的遺傳多樣性,并且這種多樣性具有與環(huán)境變量相關(guān)的生物地理和潛在的系統(tǒng)地理格局。已有的結(jié)果表明, 盡管環(huán)境變化可能很重要, 但也可能是特有的AAPB與原有島嶼生物地理學(xué)的一些假設(shè)一致(Losos, 1967), 即使沒有明顯限制它們懸浮分散在海洋中, 這表明地理的距離可能在這些微生物種群的生態(tài)結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用。而AAPB群體遺傳多樣性也與環(huán)境變量和位置相關(guān), 表明種群數(shù)量和遺傳多樣性是通過環(huán)境變量和特有機(jī)制的組合進(jìn)行調(diào)節(jié)的(Ritchie et al, 2012)。

舟山群島海域是東海地區(qū)集旅游、港口、工業(yè)、漁業(yè)、養(yǎng)殖區(qū)等于一體的重要海域。根據(jù)舟山市海洋功能區(qū)劃, 結(jié)合島礁分布和行政區(qū)劃, 在基本涵蓋舟山所有功能海域的基礎(chǔ)上, 我們選擇了 8個典型站位。本文針對這8個典型站位的表層海水樣品, 基于高通量 DNA測序的方法, 利用編碼光合反應(yīng)復(fù)合中心小亞基的pufM基因構(gòu)建文庫, 對AAPB分布及其系統(tǒng)發(fā)育多樣性進(jìn)行分析, 旨在初步探討舟山群島海域AAPB的多樣性情況, 為今后舟山群島AAPB生態(tài)學(xué)角色及其在碳循環(huán)中的貢獻(xiàn)奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及預(yù)處理

于2016年4月在舟山群島海域選擇8個代表性站位, 采樣點(diǎn)的選擇依據(jù)舟山市海洋功能區(qū)劃和行政區(qū)劃相結(jié)合的原則, 采樣站位為東極島(DJ)(122.69°°E, 30.19°N)、岱山(DS)(122.11°E,30.27°N)、沈家門(SJM)(122.32°E, 29.94°N)、枸杞島(GQ)(122.81°E, 30.72°N)、金塘島(JT)(121.85°E,30.07°N)、六橫島(LH)(122.11°E, 29.79°N)、桃花島(TH)(122.30°E, 29.81°N)、朱家尖(ZJJ)(122.41°E,29.92°N), 見圖 1。采集表層(0.5m)海水樣品各2L裝入預(yù)先滅過菌的聚乙烯采樣瓶中, 先用真空抽濾裝置經(jīng) 3μm 孔徑濾膜過濾去除大顆粒雜質(zhì), 再用0.22μm 孔徑濾膜過濾, 然后將濾膜取出, 放入已滅菌的含有石英砂的5mL離心管中, 于液氮中保存, 用于細(xì)菌DNA提取。

圖1 調(diào)查海區(qū)及采樣站位(東海舟山群島海域)Fig.1 Location of the study area and sampling stations in the Zhoushan Archipelago, the East China Sea注: 東極島(DJ), 枸杞島(GQ), 金塘島(JT), 六橫島(LH), 沈家門(SJM), 桃花島(TH), 朱家尖(ZJJ), 岱山(DS)。樣品采集于2016年4月8—30日

1.2 環(huán)境參數(shù)測定

在水樣采集的同時, 利用攜帶的便攜式 HQ-30D溶氧儀測定溶解氧和溫度, 鹽度計和 pH計分別測定鹽度和 pH, 總磷使用便攜多參數(shù)水質(zhì)分析儀(型號:5B-2H)進(jìn)行測定, 其它一些水質(zhì)參數(shù), 如 COD、氨氮、硫酸鹽、磷酸鹽、硅酸鹽、亞硝酸鹽和硝酸鹽等使用 Smartchem-200全自動間斷式化學(xué)分析儀進(jìn)行測定。

1.3 DNA的提取及檢測

將保存濾膜的 5mL離心管從液氮中取出, 在無菌的條件下, 剪碎, 加入1mL提取緩沖液, 水樣中細(xì)菌DNA具體提取步驟參照美國MOBIO公司強(qiáng)力水樣DNA提取試劑盒的說明書, 并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 AAPB pufM基因PCR擴(kuò)增

采樣針對不產(chǎn)氧光合細(xì)菌 pufM 基因擴(kuò)增引物(Achenbach et al, 2001; Béjà et al, 2002) pufM-557-f(5′-TACGGSAACCTGTWCTAC-3′) 和 pufM-750-r(5′-CCATSGTCCAGCGCCAG AA-3′), 對樣品基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增, PCR產(chǎn)物片段長度約為193bp。PCR反應(yīng)體系為95℃預(yù)變性4min, 95℃變性30s, 58℃退火 30s, 72℃延伸 30s, 循環(huán) 35次, 72℃延伸 5min。20μL反應(yīng)混合液, 包括 2μL DNA, 正反引物各 0.7μL,10μL的PCR mastermix (TaKaRa), 用水補(bǔ)齊。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5% (W/V)的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增效果。

1.5 樣品的高通量測序及數(shù)據(jù)分析流程

將樣品的 PCR產(chǎn)物, 送至上海翰宇生物科技有限公司在Illumina MiSeqTM平臺上進(jìn)行高通量測序。為了提高分析結(jié)果的質(zhì)量, 在序列充足的同時, 也要保證序列的質(zhì)量, 因此, 分析前要先對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾處理, 得到優(yōu)質(zhì)序列。然后對優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行OTU聚類分析?；贠TU聚類分析結(jié)果, 可以進(jìn)行Alpha多樣性分析, 根據(jù) OTU的物種分類結(jié)果, 可以進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。將OTU和分類學(xué)信息結(jié)合在一起進(jìn)行 Beta多樣性分析。在提供了環(huán)境因子的情況下, 可以進(jìn)行多樣性統(tǒng)計分析。

數(shù)據(jù)預(yù)處理, 使用Mothur v.1.32.1 (Schloss et al,2009) (http://www.mothur.org/wiki/Calculators)對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理, 得到優(yōu)質(zhì)序列, 并進(jìn)行統(tǒng)計。使用QIIME (Caporaso et al, 2010)聚類生成OTU, 相似性設(shè)為97%, 即任意兩條reads的相似度均達(dá)到97%以上,將該序列聚類為一個OTU。OTU代表序列與NCBI nr數(shù)據(jù)庫BlastX比對, 得到每個OTU的分類學(xué)信息。

本研究中所有的原始數(shù)據(jù)全部上傳到 NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRP080714), 登錄號為ID: SRP080714。

2 實驗結(jié)果

2.1 環(huán)境參數(shù)

現(xiàn)場進(jìn)行定位, 采集表層海水, 采樣深度為0.5m, 溶解氧(DO)、鹽度、pH、溫度現(xiàn)場測定, 其它水質(zhì)參數(shù), 如 COD、總磷、溶解無機(jī)氮(DIN)等帶回實驗室立即進(jìn)行檢測, 結(jié)果如表1所示。從結(jié)果可以看出, 水溫為13.8—17.2; ℃溶解氧(DO)變化不大,為10.00—11.85; pH范圍在7.65—7.92; 鹽度變化較大, 20—33, 金塘最低, 東極最高; COD 含量都符合一類海水的標(biāo)準(zhǔn); 無機(jī)氮含量桃花島最高, 為0.438mg/L, 總磷枸杞島最低, 只有0.008mg/L。

表1 采樣點(diǎn)環(huán)境參數(shù)Tab.1 The environmental parameters of each sampling station

2.2 OTU聚類和Alpha多樣性

經(jīng)過預(yù)處理的原始測序數(shù)據(jù), 一共得到 192633條序列, 我們進(jìn)行了 OTU聚類分析, 相似性設(shè)為97%, 可以看到, 所有的數(shù)據(jù)最后一共分成 4051個OTU, 各站點(diǎn) OTU聚類結(jié)果分別是 DJ 490個, GQ 670個, JT 1123個, LH 883個, SJM 1526個, TH 1204個, ZJJ 691 個(表 2)。

進(jìn)行 Alpha多樣性分析, Alpha多樣性指數(shù)(estimator), 包括: 豐度評估指數(shù)(ACE指數(shù)和Chao 1指數(shù))和多樣性評估指數(shù)(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Coverage)。從ACE指數(shù)和Chao 1指數(shù)的結(jié)果可以看出, 各采樣站點(diǎn)微生物豐富度排序是: SJM ＞ ZJJ＞ TH ＞ JT ＞ LH ＞ GQ ＞ DJ, 而從 Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)來看, 各站點(diǎn)微生物多樣性從高到低依次是: SJM ＞ LH ＞ JT ＞ TH ＞ ZJJ ＞ DJ ＞ GQ。從Coverage可以看出, 測序深度已經(jīng)足夠, 覆蓋度較高,文庫可用于評估AAPB多樣性。從稀釋性曲線(圖2)來看當(dāng)測序量超過 25000讀長時, 仍然有新的 OTU被發(fā)現(xiàn), 但是整個曲線已經(jīng)趨于平緩, 說明測序數(shù)據(jù)量合理, 更多的數(shù)據(jù)量對發(fā)現(xiàn)新 OTU的邊際貢獻(xiàn)很小, 從圖中也可以看出相同序列數(shù)時, SJM、TH和JT的OTU數(shù)比其它三個位點(diǎn)要高, DJ最低, 說明SJM、TH和JT的微生物豐富度要高于其它三個位點(diǎn), DJ的微生物豐富度最低。

表2 樣品OTUs(cutoff=0.03)聚類和Alpha多樣性指數(shù)情況Tab.2 The OTUs and the estimators of each sample (cutoff=0.03)

圖2 稀釋性曲線(cutoff=0.03)Fig.2 The rarefaction curve (cutoff=0.03)注: 橫軸為從某個樣品中隨機(jī)抽取的測序條數(shù), 縱軸為基于該測序條數(shù)能構(gòu)建的OTU數(shù)量。每條曲線代表一個樣品, 用不同顏色標(biāo)記。東極島(DJ), 枸杞島 (GQ), 金塘島 (JT), 六橫島 (LH), 沈家門 (SJM), 桃花島 (TH), 朱家尖 (ZJJ)

2.3 AAPB群落組成

根據(jù) OTU聚類分析的結(jié)果, 各采樣站點(diǎn)樣品中AAPB群落結(jié)果組成基本相似, 大部分序列都屬于未明確分類的細(xì)菌, 明確分類的門主要包括:Planctomycetes浮霉菌門, Proteobacteria變形菌門,Firmicutes厚壁菌門。AAPB在門水平上的組成分布與前人報道的結(jié)果相似(陳晨, 2014), 但是有關(guān)Planctomycetes的發(fā)現(xiàn)還不是很多。其中,Proteobacteria占已明確分類的細(xì)菌類群的絕對優(yōu)勢,各站點(diǎn)中序列數(shù)目分別是DJ 150個, GQ 43個, JT 230個, LH 819個, SJM 195個, TH 89個, ZJJ 86個, 最多的是LH, 其次是JT, 最少的是GQ。Firmicutes只在JT和 ZJJ發(fā)現(xiàn)了, Planctomycetes僅在 ZJJ檢測到 1條序列。在明確分類的各細(xì)菌門中, 屬于Proteobacteria的AAPB占到總體的97%。

各站點(diǎn)聚類分析結(jié)果中未明確分類的 AAPB占大多數(shù), 一共發(fā)現(xiàn)了 32個明確分類的屬, 明確分類的屬分類水平的分布情況見圖 3, 其中占優(yōu)勢的菌屬分別為 Roseobacter、Sphingopyxis、Loktanella、Sphingomonas、Methylobacterium 和 Escherichia, 其中前三個是所有站點(diǎn)共有的屬。其它還包括Skermanella、Brevundimonas、Thalassobium、Bacillus、Isosphaera、Ahrensia、Maritimibacter、Rhodobacter、Sulfitobacter、Elioraea、Erythrobacter、Blastomonas、Citromicrobium、Novosphingobium、Limnohabitans、Rubrivivax、Methyloversatilis、Desulfocapsa、Thiohalocapsa、Thiorhodococcus、Klebsiella、Amphritea、Cellvibrio、Pseudomonas和 Cycloclasticus。有些屬只在某一個位點(diǎn)或其中幾個位點(diǎn)發(fā)現(xiàn), 例如,Isosphaera、 Maritimibacter、 Desulfocapsa、Thiorhodococcus、Klebsiella和 Amphritea只存在于ZJJ, Ahrensia、Blastomonas和Methyloversatilis僅在JT發(fā)現(xiàn)。Sulfitobacter和Elioraea是LH特有的兩個屬, 而 Novosphingobium 是 TH 的 特 有 屬,Limnohabitans和Rubrivivax也僅在SJM檢測到?？偟膩碚f, 各位點(diǎn)明確分類的 AAPB豐度大小順序是LH＞JT＞SJM＞DJ＞TH＞ZJJ＞GQ。

表3 門水平分類結(jié)果Tab.3 The taxonomy in phylum for AAPB in each station

2.4 AAPB群落相似性分析

從屬水平的樣品間聚類關(guān)系樹(圖 4)可以看出,各采樣位點(diǎn)之間的群落結(jié)構(gòu)相似性, 其中LH和SJM相似性較高, DJ和GQ相似性最高, 然后TH和DJ、GQ兩個比較相似, ZJJ又和DJ、GQ和TH相似性較高, JT和其它位點(diǎn)相似性是最低的。Heatmap圖可以很直觀的反映各位點(diǎn)在 AAPB屬水平上群落組成的相似性和差異性(圖 5)。橫軸代表各采樣位點(diǎn), 縱軸代表AAPB各屬, 在JT站點(diǎn), Bacillus和Erythrobacter豐度較高, 而 Roseobacter豐度相對較低, TH站點(diǎn),Sphingopyxis、Loktanella和 Roseobacter具有較高豐度, GQ主要是未明確分類的一些屬。可以發(fā)現(xiàn), 單獨(dú)分析某一個屬的時候, 各站點(diǎn)差別仍然很明顯, 比如:Roseobacter相對豐度最高的是LH, DJ和ZJJ相對豐度比較高的都是 Escherichia, 在 DJ和 SJM,Methylobacterium的豐度相對較高, Bacillus在JT和ZJJ的分布則相對較多。同樣又印證了LH和SJM具有較高相似性, ZJJ、DJ、GQ和TH相似性比較近, 而JT與其它位點(diǎn)差異性是最大的。

圖4 樣品間聚類關(guān)系樹(屬水平)Fig.4 The tree of clustering for all samples at genus level注: 下角的圖例為距離標(biāo)尺, 分支距離越長, 差異關(guān)系越遠(yuǎn)。東極島(DJ), 枸杞島(GQ), 金塘島(JT), 六橫島(LH), 沈家門(SJM), 桃花島(TH), 朱家尖(ZJJ)

RDA用于探究的AAPB豐度和環(huán)境變量之間的關(guān)系。不難發(fā)現(xiàn), 溶解氧(DO)和 pH對于除Roseobacter和Escherichia之外的AAPB各屬細(xì)菌均呈正相關(guān)性關(guān)系, 而其它的環(huán)境變量如 COD、總磷(TP)、溫度(T)、無機(jī)氮(DIN)和鹽度(salinity)對Roseobacter和Escherichia呈正相關(guān)性關(guān)系。溶解氧(DO)、總磷(TP)和 pH射線較長, 說明這三種因素對相應(yīng)的AAPB影響較大, 相關(guān)性比較明顯(圖6)。

3 討論與結(jié)論

本研究的目的是確定在舟山群島海域不同海洋功能區(qū)表層海水之間 AAPB群落組成的異同并進(jìn)一步探究AAPB與環(huán)境因子之間的關(guān)系。我們推測舟山群島 AAPB的組成類型將有可能既表現(xiàn)出特有性又具有世界大同主義的細(xì)菌群落的格局。

圖5 AAPB屬水平的Heatmap圖Fig.5 The Heatmap of AAPB in the sampling stations at genus level注: 每小格代表其所在樣品中某個物種的相對豐度, 顏色對應(yīng)的是最上面的色階, 不同顏色代表物種所占比例, 從綠到紅, 代表該樣本橫坐標(biāo)的豐度越高。東極島(DJ), 枸杞島(GQ), 金塘島(JT), 六橫島(LH), 沈家門(SJM), 桃花島(TH), 朱家尖(ZJJ)

圖6 AAPB與環(huán)境參數(shù)之間關(guān)系的RDA分析Fig.6 Ordination plot of redundancy analysis (RDA) for AAPBs with hydrochemical data (environmental variables)注: 溫度(T), 溶解氧(DO), 鹽度(salinity), 化學(xué)需氧量(COD)無機(jī)氮(DIN)總磷(TP)。東極島(DJ), 枸杞島(GQ), 金塘島(JT), 六橫島(LH),沈家門(SJM), 桃花島(TH), 朱家尖(ZJJ)

所有的測序結(jié)果按照 97%的相似值, 一共歸為4051個 OTU中, 每個采樣站點(diǎn)的 OTU數(shù)不等, 為490—1526個。其中, 有28個OTU是所有站點(diǎn)共有的, 并且所含序列數(shù)占總測序條數(shù)的70%?；贠TU聚類分析的結(jié)果, 我們計算了每個樣品的α多樣性指數(shù)(表 2)。 7個站點(diǎn)獨(dú)有的 OTU數(shù)目分別是 DJ 10個、GQ 14個、JT 14個、LH 17個、SJM 33個、TH 24個、ZJJ 28個。Chao 1和ACE指數(shù)通常用來計算豐富度情況, 而Shannon和Simpson指數(shù), 被用來估計多樣性。結(jié)果表明, 多樣性是排名為: SJM ＞ LH ＞JT ＞ TH ＞ ZJJ ＞ DJ ＞ GQ, 而豐富度排名為: SJM ＞ZJJ ＞ TH ＞ JT ＞ LH ＞ GQ ＞ DJ。在各種樣品中 OTU的變化中也觀察到類似的趨勢。稀釋性曲線很好地展示了各樣品測序的情況, 此外結(jié)合Alpha多樣性指數(shù),可以得出結(jié)論: SJM微生物豐富度和多樣性都是最高的, LH、JT和TH也都比較高, 而DJ和GQ微生物豐富度和多樣性最低(圖2)。

與以往的研究相比(Zhang et al, 2007; Yutin et al,2009; Zeng et al, 2016; Zhang et al, 2016),α-Proteobacteria, γ-Proteobacteria 為優(yōu)勢類群, 而我們的樣本中細(xì)菌群落是由 α-Proteobacteria,γ-Proteobacteria, β-Proteobacteria, δ-Proteobacteria,Bacilli和 Planctomycetia 為主(圖 4)。α-Proteobacteria已經(jīng)被廣泛研究(Alexandre et al, 2008), 它們在赤潮的時候有明顯的增殖活動, 在沿岸和大洋環(huán)境中為主流群體(Gl?ckner et al, 1999; Pinhassi et al, 2000;Eilers et al, 2001; Alonso-Sáez et al, 2007)。近年來, 赤潮在DJ和GQ發(fā)生的頻率比以往更高, 可能與它們相對豐度降低有關(guān), 特別是當(dāng)與γ-Proteobacteria相比較的時候(Teira et al, 2007)。另一方面, 曾經(jīng)有幾個α-Proteobacteria豐度增大的情況, 例如 Roseobacterlike細(xì)菌豐度隨著正烷烴的增加而增大(McKew et al,2007)。雖然一些報告已經(jīng)描述過從烴污染海洋環(huán)境中分離 α-Proteobacteria的分類, 但還是難以確認(rèn)這些微生物是否能夠降解或利用烴。一項對印度尼西亞海水中烴類降解菌的研究顯示, 屬于Sphingomonadales和 Rhodobacterales的不同的海洋α-Proteobacteria屬的細(xì)菌參與了脂肪族和低分子量芳烴的降解過程(Harwati et al, 2007)。值得注意的是, 在波羅的海北部夏季分層條件下, 當(dāng)細(xì)菌的生長受養(yǎng)分可利用性的限制時, Sphingomonas屬種類占浮游細(xì)菌的主導(dǎo)地位(Pinhassi et al, 2000)。巧合的是這兩種類型的細(xì)菌在各采樣位點(diǎn)均被發(fā)現(xiàn)并鑒定出, 而最高是 LH, 其原因可能是因為它位于與許多有機(jī)污染物的污水區(qū)域。

一些結(jié)果表明, 屬于Rhodobacteraceae的AAPB在沿岸海域具有非常重要的影響。類似的結(jié)果, 在貧營養(yǎng)的西太平洋(Zheng et al, 2015)和極地沿海地區(qū)(Zeng et al, 2016)也有發(fā)現(xiàn), 這表明AAPB更喜歡高透光的表層海水。屬于 Rhodobacteraceae科的Loktanella和Roseobacter兩個屬的 AAPB在所有的采樣站點(diǎn)中都處于優(yōu)勢地位, 而在細(xì)菌屬的分類水平上, ZJJ和JT比其它樣本具有更高的多樣性(圖3)。Roseobacter進(jìn)化枝在海水中的廣泛分布已經(jīng)通過多種分子技術(shù)得到證實(Schmidt et al, 1991; González et al, 1997; Lanoil et al, 2000), 這些生物體是海洋浮游細(xì)菌的一個重要組成部分(Giovannoni, 2000)。目前,仍然缺乏足夠的知識去了解這一群體在海洋環(huán)境中的作用和功能。因此, 需要全面的研究以提高我們對α-Proteobacteria在海洋環(huán)境中的烴降解生態(tài)位的理解。

在JT和SJM也被發(fā)現(xiàn)了β-Proteobacterial群體(約占 3%), 然而很少有在除了淡水環(huán)境和河口以外其它環(huán)境中發(fā)現(xiàn) β-Proteobacterial-like AAPB序列的報道(Ritchie et al, 2012)。Bouvier等(2002)在兩個河口發(fā)現(xiàn)了沿著鹽度梯度變化的細(xì)菌群落組成, 發(fā)現(xiàn)鹽度是β-Proteobacteria額外的控制因素。而伽瑪變形菌的成員被認(rèn)為是海洋表層水中的重要的代表細(xì)菌,這也就意味著它們能夠快速生長并能迅速降解海洋中更容易被降解的有機(jī)成分(Pinhassi et al, 2003;Poretsky et al, 2005)。與以往的研究一致, 它們在大西洋、波羅的海和北太平洋(Hu et al, 2006; Masín et al,2006; Boeuf et al, 2013)中占主導(dǎo)地位。在高緯度(＞60°N, ＞60°S)和極地水域缺乏伽馬變形細(xì)菌的情況相對于全球性的分布趨勢是一個例外, 表明其成員無法在冰冷的海水環(huán)境中發(fā)展壯大(Koh et al, 2011;Boeuf et al, 2013)。依賴培養(yǎng)的和非培養(yǎng)的研究表明,AAPB多樣性體現(xiàn)在擁有許多α-, β-和γ-Proteobacteria的成員(Jeanthon et al, 2011)。然而δ-Proteobacteria綱的Desulfocapsa屬在ZJJ的發(fā)現(xiàn), 實屬罕見。在先前的研究報道中, 在石油污染潮下帶沉積物中曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)過它的存在(Acosta-González et al, 2013)。在AAPB的相關(guān)研究中, 至今幾乎很少有涉及到δ-Proteobacteria綱細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)。究其原因, 這可能與環(huán)境有關(guān), ZJJ屬于捕撈區(qū), 基于Azam等(1994, 2007)提出了海洋微食物環(huán)的概念, 捕撈區(qū)必定具有高豐度的浮游生物, 從而相應(yīng)地微生物種類和豐度也會更多。

基于非培養(yǎng)的分子技術(shù), 如熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH), 末端限制性片段長度多態(tài)性圖譜技術(shù)(Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism, T-RFLP)和 puf操縱子大量的插入克隆分析, 拓展了我們對AAPB多樣性和豐度的認(rèn)識(Grüntzig et al, 2002; Cottrell et al,2006)。與傳統(tǒng)的基于分離培養(yǎng)的數(shù)據(jù)相比, 在不同類型的功能區(qū), AAPB 含有 α-, β-, δ-和 γ類的變形菌, 并支持 AAPB多樣性遠(yuǎn)不止兩個容易被培養(yǎng)的Erythrobacter和Roseobacter屬這一觀點(diǎn)。盡管已經(jīng)有許多關(guān)于 AAPB在不同的地理位置和營養(yǎng)條件下的群落結(jié)構(gòu)的研究(Zeng et al, 2009; Lehours et al,2010), 但尚未發(fā)現(xiàn)有沿著各種類型海洋功能區(qū)的AAPB分布的研究。我們探索了AAPB在不同功能區(qū)域表層海水的分布, 利用基于 pufM基因的高通量測序的數(shù)據(jù)。共得到 32個明確分類的屬和 7個屬于Proteobacteria綱未分類的屬(圖3), 而大多數(shù)OTU屬于未明確分類的AAPB的分支。這些屬分別被劃分為16科、15目、6綱和3門。在結(jié)果中, 豐度和多樣性相對較高的是變形桿菌, 其中也包含了大多數(shù)綱、目和科, 其次是厚壁菌門和浮霉菌門(表3)。尤其是屬于δ-Proteobacteria的 pufM 基因的發(fā)現(xiàn), 使我們確信AAPB多樣性的復(fù)雜程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出目前所了解的情況。

溫度是促進(jìn) AAPB生長的一個重要環(huán)境因素(Masín et al, 2006; Ferrera et al, 2014; Koblí?ek, 2015;Lew et al, 2015)。巴倫支海的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)強(qiáng)烈的線性相關(guān)性, 在溫度最高時 AAPB的豐富度和多樣性最高(Lehours et al, 2015)。然而, 在極度貧營養(yǎng)的寒冷的高山湖泊, 電導(dǎo)率、pH值、硝酸鹽含量是影響AAPB群落結(jié)構(gòu)分布和生長的主要因素(Koblí?ek, 2015)。在我們的研究中, Roseobacter屬在LH的豐度最高, 這可能表明溫度是某些Roseobacter屬細(xì)菌生長的至關(guān)重要條件。AAPB的豐度與pH值在我們研究的范圍內(nèi)呈正相關(guān), pH值顯著影響阿加西斯泥炭地冰川湖細(xì)菌群落的組成和紐約阿迪朗達(dá)克公園物種多樣性和豐富度(Frischer et al, 2008, Lin et al, 2012)。AAPB的豐度也可能直接或間接地受到其它因素(如水化學(xué)性質(zhì)和pH值)的影響。水的pH值也可能會顯著改變原生生物和植食性浮游動物的組成。已有研究證明,AAPB經(jīng)常處在激烈的被捕食的壓力下, 植食性浮游動物群落的改變可能也會嚴(yán)重影響 AAPB的數(shù)量(Ferrera et al, 2011)。另一個關(guān)鍵的環(huán)境因素是鹽度,它對海洋微生物的生長也有至關(guān)重要的影響。據(jù)報道,在特拉華河口和北冰洋西部的 AAPB受到環(huán)境鹽度變化影響(Waidner et al, 2008; Boeuf et al, 2013), 但這種影響關(guān)系在本研究中未發(fā)現(xiàn)。雖然鹽度變化很大(表 1), 在這些變化下的背后可能生存著許多具有相應(yīng)生理耐受性的AAPB種群?？赡艿脑蚴? 不同鹽度的水域之間, 光線充足時, 光合異養(yǎng)可能在溫暖、高鹽度的水和寒冷、低鹽度的水中具有不同的生理作用。除了溫度以外, 不同的鹽度也導(dǎo)致 ZJJ的 pufM多樣性高于JT和LH。

Zohary和Robarts得出結(jié)論認(rèn)為, 冬季在地中海東部, 磷是細(xì)菌和浮游植物大面積生長的最主要的限制性營養(yǎng)物質(zhì)(Zohary et al, 1998)。同樣, 在夏天的地中海西北面水域, 磷的限制性作用也很常見(Zweifel et al, 1993, Sala et al, 2002)。此外, AAPB是一類快速生長代謝活躍的生物, 它們極大地促進(jìn)了溶解氧的補(bǔ)充。我們可以得出結(jié)論認(rèn)為, DO是影響許多細(xì)菌屬分布的一個重要因素(圖 6)。另外, 從采樣站點(diǎn)pufM基因的OTU分類結(jié)果表明, AAPB特有分支與特定環(huán)境條件有關(guān)。這些結(jié)果表明觀察到的AAPB豐度的變化往往也會伴隨著種群的遺傳多樣性變化(圖 5)。從屬的分布情況來看, Isosphaera、Maritimibacter、Desulfocapsa、Thiorhodococcus、Klebsiella和 Amphritea這幾個屬只在朱家尖(ZJJ)被發(fā)現(xiàn), Ahrensia、Blastomonas和 Methyloversatilis僅屬于金塘島(JT), Sulfitobacter和 Elioraea只在六橫島(LH)存在, 而Novosphingobium也僅在桃花島被發(fā)現(xiàn)(TH), Limnohabitans和 Rubrivivax只存在于沈家門(SJM)(表4)。它們的生理適應(yīng)和代謝靈活的本性表明了光能異養(yǎng)為其提供了選擇性的優(yōu)勢。所有的物理和化學(xué)因素都可能在構(gòu)建 AAPB種群結(jié)構(gòu)時起到單獨(dú)或協(xié)同作用。數(shù)據(jù)表明, 不同的AAPB群體被各種復(fù)雜的環(huán)境因素所控制, 這或許可以解釋為什么目前很難準(zhǔn)確預(yù)測水生環(huán)境總AAPB分布的問題。

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