左 群，于新凱

(上海體育學院運動科學學院，上海 200438)

體育科學研究中開展動物實驗越來越普遍。開展動物實驗必須遵循國際上實驗動物福利的要求，其中“3R”原則是核心內(nèi)容。但在體育科學研究中，存在對實驗動物的福利問題關注度不高，對實驗動物福利所要求的“3R”原則知曉率低等狀況。實驗動物的福利問題直接影響實驗動物的身心健康，對實驗結(jié)果的準確性產(chǎn)生重要影響。因此，在我國體育科學研究日趨國際化、交流日益頻繁的今天，加強對實驗動物“3R”原則在體育科學研究中的認識和應用就顯得尤為重要和迫切。

1 實驗動物的“3R”原則

實驗動物是為了科學研究而專門培育或改造的一類動物，主要用于科學實驗研究。作為一種生命形式，和人類一樣，實驗動物同樣具有自身生理和心理的各項需求。作為人類的替身，實驗動物需要經(jīng)受各種實驗因素的處理，由此遭受生理或心理的痛苦[1]。因此，在使用實驗動物時應保障實驗動物福利，遵循實驗動物倫理要求，善待實驗動物，盡量減少對實驗動物的生理和心理傷害，確保實驗動物的一切狀態(tài)都有利于科學研究的正常進行，將對實驗研究的背景性干擾降到最低，以最少的動物代價獲得最大的科學效益。動物福利的首要原則是滿足動物維持生命的需要、維持健康的需要及維持舒適的需要，這3個方面決定了動物的生活質(zhì)量[2]。解除動物痛苦，讓動物在任何條件下享有“5大自由”是動物福利的基本原則，包括：(1)不受饑渴的自由；(2)生活舒適的自由；(3)不受痛苦、傷害和疾病的自由；(4)生活無恐懼和悲傷感的自由；(5)表達天性的自由。生理健康、心理快樂、有益于科學研究是實驗動物福利的完整內(nèi)涵[3]。

如何在開展動物實驗過程中保障實驗動物福利，“3R”原則是重要核心內(nèi)容?！?R”原則由動物學家Russell 和微生物學家Burch 于1959 年提出，指的是Reduction(減少)、Replacement(替代)和Refinement(優(yōu)化)[4]。減少指的是在動物實驗研究中，為了減少動物所承受的痛苦總量，要盡量減少實驗動物的使用數(shù)量。替代指的是盡量使用沒有知覺的實驗材料(體外方法)替代活體動物(體內(nèi)方法)，或使用低等動物替代高等動物進行實驗，并獲得相同實驗效果的科學方法。優(yōu)化指的是在符合科學原則的基礎上，通過改善實驗環(huán)境條件，善待動物，提高動物福利[1]。2005 年，美國芝加哥的“倫理化研究國際基金會”還在“3R”的基礎上提出了“4R”原則，增加了“Responsibility”(責任)作為第4 個原則，要求人們在生物學實驗中增強倫理觀念，呼吁實驗者對人類和動物都要有責任感[5]?！?R”原則與實驗動物福利有著密切的關聯(lián)，“3R”技術和方法的應用為實現(xiàn)實驗動物福利提供了有力的保障。

2 體育科學研究中動物實驗的特點

體育科學研究中開展動物實驗的領域相當廣泛，通過動物實驗研究者可以從分子、細胞、組織、器官、系統(tǒng)等水平深入探討運動在提高運動能力、改善健康、預防疾病、延緩衰老等方面的作用機制，為運動在挖掘運動潛能、促進健康、提高生活質(zhì)量等方面的作用提供大量實驗數(shù)據(jù)。但體育科學中的動物實驗不同于生物、醫(yī)學等研究領域，在實驗動物的選擇、實驗動物的干預和處理上具有自身的特點。

2.1 實驗動物的選擇

運動是體育科學研究中主要的干預手段，因此，實驗動物能否進行運動、運動能力是否可控、運動效果能否定量化評價是必須考慮的問題。此外，實驗動物與人類的同源性或基因相似度如何，所得實驗結(jié)果是否具有代表性，實驗動物的成本和倫理要求等等也是選擇實驗動物的考量標準。綜合以上要求，目前，在體育科學研究中嚙齒類動物是使用最多的實驗動物，其次，果蠅和斑馬魚的應用在體育科學研究中也開始嶄露頭角。

嚙齒類動物大鼠和小鼠的基因組和人類有較高的同源性，生理、生化和發(fā)育過程和人類相似，同時具有相對可控的運動能力，通過設定跑臺的速度和運動時間、游泳運動的時間等可建立規(guī)律的運動訓練方案。因此，嚙齒類動物在體育科學研究中使用最多。根據(jù)實驗目的和要求，可以選擇不同品系、年齡、性別的實驗動物。如大鼠的Sprague-Dawley(SD)、Wistar、Lewis品系[6-7]，小鼠中的BALB/C、C57BL/6、ICR品系都是體育科學研究中常用的實驗動物[8-10]。

作為低等生物，果蠅擁有許多與人類同源的基因，是衰老、神經(jīng)生物學的研究中常用的模式生物。和哺乳動物相比，果蠅是唯一具有心臟的無脊椎動物，且心臟組織分化精細。加上果蠅生命周期短(平均壽命60天左右)，表型易于觀察。因此，果蠅是研究心臟遺傳與發(fā)育基因調(diào)控的理想模式動物[11-12]。近些年來果蠅在體育科學研究中的應用也開始得到關注[13-14]。如鄭瀾等[15]發(fā)現(xiàn)，果蠅攀爬指數(shù)隨著年齡增加而下降，運動可增強果蠅運動能力，延緩因增齡而發(fā)生的運動能力下降和心臟功能衰退，改善生命周期。類似的研究見于Piazza等的報道[16]。

作為硬骨魚的代表之一，斑馬魚的基因和人類基因的相似度達到87%，具有近似人的各種器官系統(tǒng)。斑馬魚具有紅肌和白肌，混合型肌纖維含量極少，可以通過水流的速度來控制斑馬魚的運動強度，結(jié)合運動時間產(chǎn)生有氧或無氧運動效果，是研究運動訓練適應性的理想模型[17]。如有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過4周無氧運動訓練后，斑馬魚肌糖原含量顯著增加，運動持久能力加強，無氧運動能力和無氧代謝能力均得以明顯提升[18]，說明斑馬魚適合應用于體育科學研究中。

2.2 實驗動物模型的選擇

除了野生型實驗動物，疾病模型、轉(zhuǎn)基因、基因(或受體)敲除或基因過表達的實驗動物在體育科學研究中的使用也越來越普遍。

在運動影響和改善相關疾病的研究中，通常采用動物造模的方式，獲得相關疾病模型，同時結(jié)合運動，觀察運動對相關疾病的影響。例如通過摘除大鼠卵巢造成骨質(zhì)疏松模型后，觀察不同運動以及補充維生素D3和尼古丁對骨質(zhì)疏松大鼠骨丟失的影響[19]；飼喂高糖高脂膳食獲得肥胖動物模型后，觀察跑輪運動和熱量限制對肥胖大鼠肥胖和下丘腦神經(jīng)肽表達的影響[20]；固定懸吊動物后肢獲得肌肉廢用模型后，觀察有氧運動對骨密度和肌肉萎縮的影響[21]；在衰老研究中，通過D-半乳糖誘導小鼠衰老后，觀察運動對神經(jīng)干細胞增殖和神經(jīng)母細胞分化的影響[22]等等。

為了深入了解運動影響疾病的代謝機制，轉(zhuǎn)基因、基因(或受體)敲除、基因過表達實驗動物的應用擴大了研究視角，使研究者得以在基因水平或相關信號通路上獲得直接實驗證據(jù)。如針對阿爾茨海默病(Alzheimer’S disease, AD) 建立β-淀粉樣前體蛋白/早老素1(β--amyloid precursor protein/presenilin-1, APP/PS1)轉(zhuǎn)基因小鼠，觀察運動對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學習和記憶的影響[23]；通過hSl00B轉(zhuǎn)基因小鼠研究Sl00B基因在帕金森病發(fā)病機制中的作用[24]；在脂代謝研究中，采用ApoE基因或LDL受體敲除小鼠來探討運動改善機體脂代謝的分子機制[25-26]；構建NAD合成酶基因CG9940全身過表達并進行運動干預，研究NAD合成酶基因CG9940過表達對果蠅運動能力、心臟功能和壽命的影響[11-12]等等都是轉(zhuǎn)基因、基因(或受體)敲除、基因過表達實驗動物的成功應用。隨著分子生物學實驗技術和手段的不斷發(fā)展和完善，將RNA干擾技術應用于實驗動物導致目的基因沉默[27-28]，借此觀察運動對機體的影響機制是在基因水平認識運動影響機體代謝機制的又一舉措。

2.3 實驗動物的運動干預

從運動干預手段來看，嚙齒類動物主要以跑臺[6]、游泳[7]、轉(zhuǎn)籠或跑輪[20,29]運動或振動訓練[30]，果蠅是攀爬運動[31]，斑馬魚則是游泳運動[17-18]；在運動形式上既有主動運動[23]，也有被動運動[31]；在運動強度上，有大強度、中等強度和低強度運動之分；在運動時間的安排上，既有短時間急性運動，也有長時間耐力運動；在運動類型上既有無氧運動，也有有氧運動；在運動環(huán)境上，既有常溫常壓環(huán)境，也有低氧低壓[32]、低溫[33]、高熱[34]環(huán)境下運動的研究。通過運動的干預，能夠發(fā)現(xiàn)運動對機體的影響效果(正面或負面)；通過對比不同運動方式、不同運動強度、不同運動時間、不同運動環(huán)境下產(chǎn)生的運動效果，發(fā)現(xiàn)適合不同年齡、性別、生理或疾病狀況下的最佳運動模式。

運動是體育科學研究的特色，因此，在開展動物實驗時要特別考慮到這些運動干預因素對實驗動物福利的影響，“3R”原則同樣適用于體育科學研究的動物實驗中。

3 體育科學研究中“3R”原則的要求和應用

3.1 減少

在體育科學研究中，為了減少動物所承受的痛苦總量，要盡量減少實驗動物的使用數(shù)量。

從絕對數(shù)量的減少上看，在確保實驗結(jié)果不受影響的前提下，實驗前，應根據(jù)實驗目的，通過統(tǒng)計學計算所需要的實驗動物樣本數(shù)，不無故擴大樣本量。實驗前必須進行周密合理的實驗設計，減少混雜因素對實驗結(jié)果的影響，不進行無科學意義的實驗。實驗前的預實驗非常重要，通過少量實驗動物的預處理，了解實驗方案的可行性，盡早發(fā)現(xiàn)問題，避免正式實驗時大量實驗動物的無效使用。另外，課題組之間可以共用實驗動物模型，避免實驗動物取材上的浪費。從相對數(shù)量的減少上看，取得實驗數(shù)據(jù)后，要進行正確的統(tǒng)計學分析，充分利用已有的數(shù)據(jù)，以最少的實驗動物數(shù)量獲得最大化的實驗結(jié)果。同時建立互信機制，共享實驗數(shù)據(jù),減少不必要的重復實驗。

例如，王妹等[35]從GEO數(shù)據(jù)庫中下載Lehti等提交的小鼠骨骼肌基因芯片數(shù)據(jù)，運用生物信息學的方法對其中的差異表達基因做進一步的功能富集分析，從整體上分析運動對糖尿病小鼠骨骼肌基因的影響。米春娟[36]從以質(zhì)譜為基礎的蛋白質(zhì)組學研究入手，分析了不同類型運動對心臟蛋白質(zhì)組的影響，同時用生物信息學方法分析來自于不同運動類型與動物模型間的數(shù)據(jù)。這些研究充分體現(xiàn)了“3R”原則中的“減少”，利用原作者沒有深入挖掘的實驗數(shù)據(jù)產(chǎn)生了新的研究結(jié)果，為后期的研究提供了數(shù)據(jù)基礎，減少了不必要的重復動物實驗。目前，基因組學、蛋白質(zhì)學、代謝組學、免疫組學等等的研究為生物醫(yī)學領域提供了大量的實驗數(shù)據(jù)，而且數(shù)據(jù)規(guī)模還在不斷增長。如何從這些海量數(shù)據(jù)中查找或挖掘所需要的信息，產(chǎn)生新的研究結(jié)果，跨越單一動物實驗的局限性是體育科研工作者需要思考的問題。

此外，提高實驗動物的質(zhì)量，控制生物學變異也是實現(xiàn)相對數(shù)量減少的重要方法。在研究方法和手段上，充分利用現(xiàn)代生物技術進行分析(如核磁共振、CT、雙能X射線)，既可減少對實驗動物的侵襲，又可進行持續(xù)觀察，節(jié)約實驗動物。

3.2 替代

目前，在體育科學研究中，“替代”研究成為一種新的趨勢，包括細胞體外試驗、低等動物替代高等動物進行實驗等。

以骨骼肌的研究為例，在體實驗通常以嚙齒類動物為實驗對象，運動干預后對實驗動物進行取材，通過特異性標記物在體觀察或檢測運動對骨骼肌細胞形態(tài)或功能的影響，探討運動影響骨骼肌的相關機制[37-38]。除此之外，原代細胞培養(yǎng)不失為一種良好的選擇，由于細胞剛剛從活體組織分離出來，故更接近于生物體內(nèi)的生活狀態(tài)。同時，選擇小鼠成肌細胞系C2C12作為實驗對象，通過電刺激使成肌細胞收縮產(chǎn)生運動效果，離體觀察和研究模擬運動對肌細胞形態(tài)或功能的影響及機制也是一種重要選擇[39-40]。和在體實驗相比，細胞離體實驗可控性好，樣本需要量少，能縮短實驗周期，提高實驗效率，具有動物實驗所沒有的優(yōu)勢。

作為一種成熟的模式生物，人類75%的疾病基因與果蠅具有功能同源[41-42]，而運動能促使果蠅產(chǎn)生行為和生理應答[43]。果蠅運動能力較強，但其遷移運動表現(xiàn)為非定向的飛行或爬行，這種運動模式在實驗條件下很難建立規(guī)律的運動訓練方案。為此，國內(nèi)有研究者利用果蠅的負趨地性，研制出果蠅運動平臺裝置，通過果蠅的抗重力攀爬來測量果蠅的運動能力[43]。國外有研究者利用果蠅的負趨地性進一步開發(fā)出踏輪裝置[44]和旋轉(zhuǎn)運動量化裝置[45]，使得果蠅的運動訓練趨于科學和完善，運動表現(xiàn)定量化，為果蠅在體育科學研究中的應用創(chuàng)造了條件。果蠅容易飼養(yǎng)、繁殖快、生命周期短、取材方便，遺傳背景可控，和哺乳動物相比，研究成本和研究周期能得到極大節(jié)約，研究結(jié)果也非常具有代表性。因此，作為一種理想的動物模型，果蠅在體育科學研究中的應用應該得到大力推廣。

和小鼠相比，斑馬魚的繁殖力強、發(fā)育迅速，容易飼養(yǎng)，目前在遺傳發(fā)育、藥物篩選、疾病模型、環(huán)境健康等研究領域得到廣泛的應用[46-47]。同時，隨著年齡的增加斑馬魚整體功能下降，如線粒體功能下降、骨骼肌退化等，呈現(xiàn)出和人類以及其他哺乳動物相似的特點[48]。隨著年齡增加，斑馬魚的游泳能力也隨之下降，運動訓練能提高斑馬魚的游泳能力，其中青年和中年斑馬魚的訓練效果顯著好于老年斑馬魚，和人類的運動效果相似[49]，提示斑馬魚可望成為研究運動與衰老的良好模型[50]。此外，斑馬魚的骨骼與人類相似，同樣擁有骨細胞[51]。研究發(fā)現(xiàn)運動訓練可以促進成年斑馬魚的骨形成，提高骨密度[52]。在骨骼肌的研究中發(fā)現(xiàn)，游泳運動訓練可以通過mTOR-MEF2和AMPK信號通路使得成年斑馬魚快肌纖維肥大，促進肌再生[53]，這些研究結(jié)果和哺乳動物的相似。目前，作為一種新型的實驗動物模型，斑馬魚已經(jīng)應用在運動與肌肉生長發(fā)育、骨骼代謝、神經(jīng)生物學與衰老等研究領域中[54-58]。和大小鼠模型相比，斑馬魚的模型建立成本低，取材方便，因此，可望在體育科學研究中得到開發(fā)和應用。迄今為止，斑馬魚在運動實踐中的應用僅見國外的研究中，國內(nèi)尚未見報道。因此，國內(nèi)的體育科研工作者應該加快認識和開發(fā)斑馬魚在運動實踐中的應用。

另外，充分利用人群資料來代替動物實驗的資料，利用數(shù)學模型、電子圖像分析、虛擬動物和虛擬人體來模擬相應的生理和代謝過程都是替代的良好手段和方式，在體育科學研究中應該大力推崇。

3.3 優(yōu)化

優(yōu)化包括動物實驗的研究方法、技術手段和操作控制技術的優(yōu)化。在動物實驗過程中，通過改善實驗環(huán)境、飼養(yǎng)條件，完善實驗程序，改進實驗技術，善待實驗動物，由此提高動物福利。早在2006年我國科技部就頒布了《關于善待實驗動物的指導性意見》，要求在飼養(yǎng)管理和使用實驗動物過程中，要采取有效措施，善待實驗動物，使實驗動物免遭不必要的傷害和痛苦[59]。

體育科學研究中通常要對實驗動物施加運動刺激，善待實驗動物的原則同樣適用。以跑臺運動為例，在實施力竭運動時，大鼠通常會因為體力不支，無法跟上設定的跑臺速度，退縮到跑臺末端。為了讓動物繼續(xù)運動以達到力竭，實驗操作人員往往用電擊或毛刷刺激大鼠尾部，驅(qū)使大鼠跑動。如果電擊的強度適宜，尚不會使大鼠產(chǎn)生過大的應激；如果電擊的強度過大，會使大鼠產(chǎn)生驚恐等惡性應激，導致生理和心理的雙重刺激，無法確保實驗結(jié)果的準確性。因此，不建議使用電擊的方法。同時，跑臺運動時有聲、光、電的刺激，對于不運動的對照組，雖然不在跑臺上運動，實驗動物也應置于跑臺上感受相同環(huán)境的刺激，確保研究背景的一致性，減少實驗誤差。另外，在高強度的跑臺運動中，由于跑臺設定的速度過快，大鼠一旦沒有跟上皮帶轉(zhuǎn)動的速度，極易出現(xiàn)后肢及尾部夾傷；夾傷后如果沒有及時予以藥物處理，大鼠的后肢腳趾和尾部會出現(xiàn)感染和潰瘍，嚴重的導致死亡，這些行為都是屬于違背實驗動物福利的要求。應該給予實驗動物及時的護理和治療，善待實驗動物。在游泳運動中，如果水溫沒有調(diào)節(jié)好，水溫過高或過低對大鼠將造成熱應激或冷應激，這些都要避免。游泳運動結(jié)束后，要及時擦干大鼠的毛發(fā)，防止受涼。

在進行運動干預時，根據(jù)大、小鼠晝伏夜動的生活習性，午夜活動比白天活躍，在運動時間的選擇上要考慮到其生物節(jié)律，避免對實驗動物的生理和心理造成負面影響。不同于嚙齒類動物，斑馬魚的適宜水溫為28℃，白晝/夜晚的生物節(jié)律是14 h / 10 h。對斑馬魚運動的測試通常采用安裝在游泳池上方的紅外攝像機拍攝其游泳記錄，目的是減少斑馬魚游泳的視覺障礙[50]。用于游泳的水池或水槽最好是內(nèi)壁光滑，無任何凸起或設備，以防斑馬魚在游泳過程中咬住停止游動，影響運動效果。大鼠或小鼠在游泳訓練時，往往會漂浮在水面不運動。這時不能采用打擊的方式迫使其運動。另外，在負重或過度訓練時，要防止實驗動物由于疲勞沉溺造成死亡。

4 小結(jié)

實驗動物為體育科學研究的發(fā)展做出了不可磨滅的貢獻。實驗動物的福利問題關系到實驗動物的生理和心理健康，對實驗結(jié)果會產(chǎn)生重要影響，“3R”原則是關系到實驗動物福利的有利保障。體育科學研究中應該結(jié)合動物實驗的特點，在實驗動物的減少、替代和優(yōu)化上，尋找和挖掘?qū)崿F(xiàn)“3R”原則的手段和措施：(1)在“減少”方面重視數(shù)據(jù)共享，加強數(shù)據(jù)分析，充分利用現(xiàn)代生物分析技術；(2)在“替代”方面加強低等生物的應用，其中果蠅和斑馬魚的應用可望成為新的研究手段；(3)在“優(yōu)化”方面加強實驗操作的規(guī)范化，減少對實驗動物的侵襲，減輕實驗動物的痛苦。由此，確保體育科學研究中實驗動物福利的實施，為獲得真實可靠的實驗數(shù)據(jù)提供切實保障。