劉峻屹，劉炎峻，李兆杰，徐 杰，王靜鳳，毛相朝，薛長湖(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

磷脂包括多種具有大分子多樣性的化合物，如磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰乙醇胺(PE)等[1-2]，其在多個(gè)方面發(fā)揮多效性，如炎癥、囊泡運(yùn)輸、內(nèi)吞作用、細(xì)胞周期和衰老、存活和細(xì)胞凋亡和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)[3-4]。磷脂具有相當(dāng)廣泛的工業(yè)應(yīng)用，在食品工業(yè)中可以作為乳化劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑[5]。磷脂的這些化學(xué)和物理性質(zhì)，正是依賴于其特殊的分子結(jié)構(gòu)，磷脂含有特定的極性基團(tuán)和脂肪酸[6]。磷脂結(jié)構(gòu)的修飾，無論是通過化學(xué)方法還是通過酶法已經(jīng)進(jìn)行了幾十年，并且進(jìn)行了各種不同的應(yīng)用。前者廣泛被研究，應(yīng)用于膜物理性能的改善[7-8]，后者通過磷脂酶D(PLD)進(jìn)行的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)[9-10]。對酶轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的研究大多為磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油的合成[11]。這些通過酶改性的磷脂通常具有抗癌、抗氧化等特殊的功效。比如磷脂酰絲氨酸，經(jīng)研究表明，其與腦功能作用相關(guān)，并且在改善記憶力、提高認(rèn)知、治療阿爾茨海默病、治療抑郁癥等方面發(fā)揮著重要的作用[12]。

2006年，一種新的磷脂酰糖苷，磷脂酰β-D-糖苷(PtdGlc)，從胎鼠腦的脂筏上被檢測出來。PtdGlc 由飽和脂肪酰基鏈(C18∶0和C20∶0)以及糖苷極性頭部組成，富集存在于小鼠等動物大腦皮層的星形膠質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞中，與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元的信號系統(tǒng)相關(guān)[13]。磷脂酰果糖是磷脂酰糖苷的一種，其在封裝和運(yùn)輸物質(zhì)等方面有很好的應(yīng)用前景，如在脂質(zhì)體的應(yīng)用。但脂質(zhì)體的穩(wěn)定性不好，如果在冷凍干燥的過程中，將糖加入到脂質(zhì)體中，能夠有效增強(qiáng)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[14]。另外，磷脂酰果糖也可應(yīng)用于靶向藥物或功能性成分的傳遞。但磷脂酰果糖在體內(nèi)含量較少，其合成制備方法非常有限。目前，我們旨在開發(fā)一個(gè)水相體系，以大豆卵磷脂、果糖為原料，磷脂酶D為催化劑，通過磷脂酶D催化酶法高效合成磷脂酰果糖的方法，對基質(zhì)配比、pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等進(jìn)行調(diào)控，建立磷脂酰果糖的最佳合成條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

大豆卵磷脂(磷脂含量90%)，上海源葉生物有限公司；磷脂酶D，德固賽(中國)公司；乙醚、醋酸、鹽酸、甲醇、氯仿、氯化鈣、無水乙酸鈉，均為分析純；果糖，上海源葉生物有限公司；正己烷(色譜純)、異丙醇(色譜純)和甲醇(色譜純)，德國Merck 公司；甲酸(色譜純)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Laborota 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國Heidolph公司；AB135-S型精密電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；MS 3型旋渦混勻器，德國IKA公司；超聲波清洗機(jī)；SHA-B型水浴搖床；100系列高效液相色譜儀，G6410B三重四極桿質(zhì)譜儀，配大氣壓化學(xué)電離源(ESI)，美國Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 磷脂酰果糖的制備

將果糖(949.87 mg)和含氯化鈣的醋酸-醋酸鈉緩沖液(1 mL)放在20 mL血清瓶中，在60℃烘箱中預(yù)先加熱，加入一定量的PLD使其與果糖及緩沖液在血清瓶中充分溶解；另取一個(gè)20 mL血清瓶，加入大豆卵磷脂(100 mg)和無水乙醚(1 mL)充分振蕩搖勻，然后將二者充分混合，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中充分振蕩，在一定反應(yīng)溫度下，180 r/min反應(yīng)一段時(shí)間后取出樣品，加入1 mol/L的鹽酸滅酶活，停止反應(yīng)，取一定量的反應(yīng)混合物加入2倍體積的氯仿- 甲醇(體積比2∶1)中，混勻后，靜置分層，取下層檢測。

1.2.2 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS-MS)分析

通過HPLC-MS-MS對磷脂酰果糖進(jìn)行分析。

色譜條件：Ascentis Si HPLC Pore column色譜柱(15 cm×1.0 mm，3 μm)，流速1 mL/min；進(jìn)樣量0.5 mL/min，進(jìn)樣體積5 μL；流動相A為正己烷-異丙醇(體積比70∶30)，0.5%甲酸，0.08%氨水；B為異丙醇-水(體積比100∶13)，0.5%甲酸，0.2%氨水；梯度洗脫程序見表1。質(zhì)譜條件：負(fù)電噴霧離子化(ESI)；一級質(zhì)譜掃描范圍(m/z)600～1 000；二級質(zhì)譜掃描范圍(m/z)50～1 000；毛細(xì)管電壓4 000 V；噴霧氣壓275.8 kPa；干燥氮?dú)饬魉?.0 L/min；氣體溫度350℃。

表1 梯度洗脫程序

1.2.3 磷脂酰果糖的純化

采用LC-Si柱進(jìn)行脂質(zhì)組分的分離純化。取上述反應(yīng)得到的10 mg磷脂酰果糖樣品溶于 0.2 mL 氯仿中，待上柱。將LC-Si依次用適量的甲醇、氯仿溶液進(jìn)行洗脫，活化LC-Si柱，待硅膠柱呈現(xiàn)透明狀，說明柱子已活化完全。待樣品上柱后依次用10 mL氯仿，5 mL氯仿-甲醇(體積比 9∶1)，3 mL氯仿-甲醇(體積比2∶1)，5 mL氯仿-甲醇(體積比1∶2)，5 mL甲醇洗脫，分別進(jìn)行收集。3 mL 氯仿-甲醇(體積比2∶1)，5 mL氯仿-甲醇(體積比 1∶2)部分，即為所得樣品。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC-MS-MS檢測磷脂酰果糖

大豆卵磷脂的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)通常是由有機(jī)相和水相兩種體系組成的[1]。在研究中，充分利用生物酶的催化具有高選擇性的作用，采用PLD在醋酸-醋酸鈉緩沖液的系統(tǒng)中催化大豆卵磷脂和果糖的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。圖1為磷脂酰果糖的總離子流圖和母離子掃描質(zhì)譜圖。

由圖1可知，在負(fù)離子模式下，磷脂酰果糖的出峰時(shí)間在6～8 min，提取磷脂酰果糖峰進(jìn)行分析，可以看到不同質(zhì)荷比(m/z)的磷脂酰果糖，對磷脂酰果糖的二級質(zhì)譜進(jìn)行分析，其中，2個(gè)主要的峰m/z833.52和857.51，代表2種不同脂肪酸組成的磷脂酰果糖。

圖1 負(fù)離子模式下磷脂酰果糖的總離子流圖(a)和母離子掃描質(zhì)譜圖(b)

2.2 底物摩爾比對磷脂酰果糖合成的影響

底物(果糖與大豆卵磷脂)摩爾比會影響水解反應(yīng)與轉(zhuǎn)磷脂酰反應(yīng)的競爭，從而影響磷脂酰果糖的合成率。在反應(yīng)溫度40℃、pH 6、反應(yīng)時(shí)間12 h、酶添加量90 U/mL條件下，考察底物摩爾比對磷脂酰果糖合成的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 底物摩爾比對磷脂酰果糖合成率的影響

由圖2可知，隨著底物摩爾比的增大，磷脂酰果糖的合成率逐漸提高；底物摩爾比為1∶45時(shí)，磷脂酰果糖的合成率達(dá)到最高，為89%；此后，底物摩爾比繼續(xù)增大，磷脂酰果糖合成率幾乎不變。因此，適宜的底物摩爾比為1∶45。

2.3 pH對磷脂酰果糖合成的影響

緩沖液pH是影響PLD活性的重要因素。在底物摩爾比1∶45、其他條件不變條件下，考察pH對磷脂酰果糖合成的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，在強(qiáng)酸性的環(huán)境下磷脂酰果糖的合成率幾乎為0，這可能是由于酸性較大破壞了PLD的分子結(jié)構(gòu)，從而影響了酶的活性；當(dāng)pH為6時(shí)磷脂酰果糖的合成率較高，達(dá)88.9%。繼續(xù)增大pH時(shí)，水解反應(yīng)競爭逐漸增大，磷脂酰果糖的合成率下降。因此，選擇pH為6較適宜。

圖3 pH對磷脂酰果糖合成率的影響

2.4 反應(yīng)時(shí)間對磷脂酰果糖合成的影響

在底物摩爾比1∶45、pH 6、其他條件不變條件下，考察反應(yīng)時(shí)間對磷脂酰果糖合成的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對磷脂酰果糖合成率的影響

由圖4可知，反應(yīng)前12 h內(nèi)，磷脂酰果糖合成率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長逐漸提高，超過12 h后，磷脂酰果糖的合成率逐漸減少，可能是反應(yīng)時(shí)間過長，磷脂酰果糖發(fā)生了水解。因此，在12 h左右，反應(yīng)已經(jīng)達(dá)到平衡，可以選擇此時(shí)停止反應(yīng)。

2.5 反應(yīng)溫度對磷脂酰果糖合成的影響

反應(yīng)溫度是影響酶解反應(yīng)的一個(gè)重要參數(shù)，適宜的反應(yīng)溫度不但可以提高反應(yīng)速度，還有助于延長酶的使用壽命和影響反應(yīng)平衡。在pH 6、底物摩爾比1∶45、反應(yīng)時(shí)間12 h、其他條件不變條件下，考察反應(yīng)溫度對磷脂酰果糖合成的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 反應(yīng)溫度對磷脂酰果糖合成率的影響

由圖5可知，PLD在40℃達(dá)到較高的酶活反應(yīng)效率，在50℃以上酶失活，磷脂酰果糖合成率顯著降低。因此，較適宜的反應(yīng)溫度選擇40℃。

2.6 酶添加量對磷脂酰果糖合成的影響

在pH為6、底物摩爾比1∶45、反應(yīng)溫度40℃、反應(yīng)時(shí)間12 h的條件下，考察酶添加量對磷脂酰果糖合成的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 酶添加量對磷脂酰果糖合成率的影響

由圖6可知，磷脂酰果糖的合成率在一定范圍內(nèi)隨著酶添加量的增加而增加，當(dāng)酶添加量超過90 U/mL 后，酶添加量對磷脂酰果糖的合成率影響不明顯。這是因?yàn)楫?dāng)酶添加量達(dá)到一定程度時(shí)，能夠給底物提供足夠的活性中心供底物反應(yīng)，再增加酶添加量將不會影響反應(yīng)的平衡。因此，較適宜的酶添加量為90 U/mL。

綜上所述，我們可以得到水相體系中PLD催化酶法合成磷脂酰糖苷的方法。通過對基質(zhì)配比、pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等的調(diào)控，建立了磷脂酰果糖的最佳合成條件為：反應(yīng)溫度40℃，pH 6，反應(yīng)時(shí)間12 h，底物摩爾比1∶45，酶添加量90 U/mL。在最佳合成條件下，磷脂酰果糖合成率在90%左右。

3 結(jié) 論

以大豆卵磷脂和果糖為原料，采用磷脂酶D(PLD)催化合成新型磷脂酰果糖。在反應(yīng)溫度40℃、pH 6、反應(yīng)時(shí)間12 h、底物(果糖與大豆卵磷脂)摩爾比1∶45、酶添加量90 U/mL條件下，磷脂酰果糖合成率在90%左右。本合成方法具有簡單、安全、無污染，在反應(yīng)過程中無有害物質(zhì)產(chǎn)生等優(yōu)點(diǎn)。

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