許瑛瑛 胡福良 陳大福 鄭火青

（1 浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058；2 福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)院，福州 350002）

蜜蜂是一類重要的經(jīng)濟昆蟲，通過生產(chǎn)蜂產(chǎn)品和為農(nóng)作物授粉帶來巨大經(jīng)濟效益。蜜蜂孢子蟲病是由微孢子蟲寄生成年蜂中腸等組織引起的慢性傳染性疾病，病原體包括蜜蜂微孢子蟲(Nosema apis)和東方蜜蜂微孢子蟲(Nosema cerenae)。自從2006年和2007年西班牙和中國臺灣報道N. ceranae寄生西方蜜蜂[1,2]以來，關(guān)于蜜蜂孢子蟲病的研究出現(xiàn)了井噴式增長。微孢子蟲孢子能夠通過蜜蜂排泄物、受污染的蜂機具以及蜜蜂交哺行為等途徑在蜂群中輕易傳播，因而蜂群感染率和個體感染率都很高。蜜蜂孢子蟲病造成蜜蜂壽命縮短、蜂群生產(chǎn)力降低，給養(yǎng)蜂業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失，是近年來影響世界養(yǎng)蜂業(yè)的主要病害之一。蜜蜂孢子蟲病的檢測與防治是蜜蜂病害防控的一項重要內(nèi)容。

1 蜜蜂孢子蟲病的檢測

1.1 取樣方法

蜂群感染微孢子蟲的程度一般是用抽取樣本中每只蜜蜂感染的平均孢子數(shù)描述[3]。蜂群中采集蜂受微孢子蟲感染的比例最高[4-7]，其體內(nèi)孢子數(shù)量也是最多的[8]，因此可以從巢門口抓取采集蜂作為樣本檢查孢子數(shù)。為了獲得更為精確的數(shù)據(jù)，在不對蜂群生存造成不利的情況下至少一個月采集一次樣本[9]， 此外，還應(yīng)當(dāng)統(tǒng)計蜂群中感染了微孢子蟲的蜜蜂所占的比例[4, 6]。

一般而言，樣本量越多，檢測的結(jié)果越為精確。蜜蜂孢子蟲病的診斷中，不同研究者抽取進行孢子計數(shù)的樣本數(shù)并不統(tǒng)一，每群蜜蜂取樣采集蜂20只到40只不等[10-12]。生物統(tǒng)計學(xué)中當(dāng)樣本數(shù)大于或等于30只記為大樣本抽樣，因此進行蜜蜂孢子蟲病檢測時抽取樣本30只以上即可。

由于微孢子蟲特殊的孢壁結(jié)構(gòu)，在顯微鏡下能反射較亮的光，因此可以在顯微鏡視野內(nèi)觀察到橢球形的明亮孢子。按照每只蜜蜂樣本加入1 ml水的比例，將獲取的蜜蜂樣本（或取腹部）先用1/3的水充分搗碎，再加入剩余的水混合均勻，取微量置于血球計數(shù)板上，用光學(xué)顯微鏡即可看到感染情況[13]。

1.2 光學(xué)顯微鏡檢測

最早也是最簡易的蜜蜂孢子檢測方法是鏡檢法：將蜜蜂的中腸從腹部拉出，加入適量超純水研磨之后，取微量于載玻片上，用顯微鏡觀察并調(diào)節(jié)放大倍數(shù)即可觀察到孢子。

在鏡檢法的基礎(chǔ)上，使用針對孢子顯色的染料能夠降低鏡檢難度。例如，由天青和伊紅組成的Giemsa染液，能夠根據(jù)蛋白的酸堿性進行染色，將孢子染成深藍色[14]；Luna 染液將孢子染成暗紅色[15]；微孢子蟲的孢壁外層是一層蛋白質(zhì)，保護著內(nèi)層的幾丁質(zhì)成分，使用Calcofluor染料對孢壁的幾丁質(zhì)染色后不易褪色，熒光相對穩(wěn)定，且寄主組織碎片、細菌和病毒多角體不被染色，是一種非常可靠的染色劑[16,17]。

在關(guān)于微孢子蟲的研究中，往往需要對孢子的活性情況進行區(qū)分。參考細胞凋亡雙染的方法，人們將多種染料結(jié)合對孢子進行染色。由于死亡的孢子和具有活性的孢子的細胞核狀態(tài)有所差別，因此可以使用核染料染色，如DAPI，或是對膜的透過性更好的Hoechest 33342、Sybr green Ⅰ和Sytox green等。同時結(jié)合使用熒光顯微鏡或透射電子顯微鏡，能夠根據(jù)熒光顏色的不同進一步增加不同狀態(tài)孢子的可識別度[18-20]。雖然鏡檢法操作簡單，而且具有相當(dāng)高的準確度，但這種方法對操作人員的經(jīng)驗要求較高；現(xiàn)階段能夠通過染色和流式細胞儀相結(jié)合對蜜蜂微孢子蟲的孢子活性進行區(qū)分，減少鏡檢時人為因素造成的誤差[21]，但這一方法費用較高。

1.3 分子生物學(xué)技術(shù)檢測

微孢子蟲的孢子壁較厚，由蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)組成，提取其DNA難度較大。通常是先獲取微孢子蟲的孢原質(zhì)后再提取其DNA，主要方法有利用堿性條件的刺激，使極絲彈出釋放孢原質(zhì)[22]；或者采用玻璃珠破碎法和液氮研磨法提取DNA。

目前為止，PCR擴增法因較高的靈敏度和準確性，被廣泛應(yīng)用于各種微孢子蟲的種類鑒別[23]。這種方法操作較為簡單，而且能夠同時對大量樣品進行檢測，是目前蜜蜂孢子蟲病病原種類鑒定最為常用的方法。為準確進行PCR擴增，引物的設(shè)計尤為重要，微孢子蟲的16s rRNA基因是較好的選擇對象之一，這段編碼核糖體RNA的基因具有9個可變區(qū)和夾雜在其中的保守區(qū)，在生物進化過程中突變速度較慢，因此在大多數(shù)原核生物中，其序列都有所不同。

利用核酸擴增的原理，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loopmediated isothermal amplification, LAMP) 法也可以對微孢子蟲進行鑒定。該方法使用一種DNA置換酶（Bacillus stearothermophilus DNA polymerase，Bst DNA polymerase）以及4～6對特異性引物，能夠在恒溫條件下進行更高特異性的擴增，并具備反應(yīng)速度更快等特點[24]。Ptaszynska等使用兩對引物成功地對N.ceranae和N. apis進行了擴增[25]，證明了這種更加廉價和快速的檢測方法在微孢子蟲檢測領(lǐng)域方面頗有前景。除檢測孢子的有無外，被測樣品受到感染的程度也經(jīng)常是需要關(guān)注的因素，實時熒光定量PCR可對樣品的孢子進行定量。

1.4 免疫學(xué)技術(shù)檢測

除了使用PCR擴增的方法以外，免疫學(xué)方法也是較為常用的檢測方法之一。Accoceberry等根據(jù)微孢子蟲極絲蛋白和孢子表面蛋白的特異性，獲得了E.bieneusi的單克隆抗體[26]。目前通過制備對微孢子蟲特定蛋白具有抗性的抗體（SWP-32），進行酶聯(lián)免疫反應(yīng)（Methods Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），能夠更加精準且直觀地觀測到微孢子蟲的存在[9]。劉鋒（2009）制備了N. ceranae總蛋白的兔化抗體，通過ELISA檢測技術(shù)，建立了蜜蜂微孢子蟲的診斷方法，檢測靈敏性可達到103個孢子/ml[27]。該技術(shù)靈敏度雖然較高，但易產(chǎn)生非特異性反應(yīng)和交叉反應(yīng)，干擾實驗結(jié)果，在檢測蜜蜂微孢子蟲的實際應(yīng)用中尚未成熟。

2 蜜蜂微孢子蟲病的防治

因為微孢子蟲具備原核生物的一些生理特征，所以最早被分類成原核生物。然而隨著研究的進一步深入，人們發(fā)現(xiàn)微孢子蟲更應(yīng)該被歸類為真菌。通過對微孢子蟲的兩種微管蛋白(α-tublin和β-tublin)基因進行系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，微孢子蟲與接合菌門(Zygomycetes)的真菌親緣關(guān)系較近[28,29]。其他一些針對RNA聚合酶亞基和蛋白質(zhì)翻譯過程中使用的延伸因子(protein translation elongation factor, EF)基因的分類學(xué)研究也支持這一論點[30]。針對微孢子蟲，要想將其抑制甚至消滅而不損害其同為真核生物的宿主是十分困難的。兔腦炎微孢子蟲（Encephalitozoon cuniculi）能夠感染艾滋病患者，為了抑制這種孢子的繁殖，研究人員嘗試使用了許多種藥物，如阿苯達唑(Albendazole)、阿苯達唑亞砜(Albendazole Sulfoxide)、甲硝噠唑(Metronidazole)和環(huán)孢霉素(Cyclosporine)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些藥物對治療微孢子蟲并無明顯的作用，但是咪唑類藥物能夠一定程度控制孢子的侵染[31]。

對于N. ceranae，有研究表明，咪唑類藥物甲硝噠唑和磺甲硝咪唑（Tinidazole）及煙曲霉素(Fumagillin)都能夠有效抑制孢子的增殖[32]。咪唑類藥物是我國嚴禁在養(yǎng)蜂生產(chǎn)中使用的藥物，違法使用將承擔(dān)法律責(zé)任。煙曲霉素是美國養(yǎng)蜂業(yè)中用來防治蜜蜂孢子蟲病的主要藥物[33]，它能夠抑制真核生物細胞內(nèi)的甲硫氨酸胺基肽酶2(methionine aminopeptidase2, MetAP2)的活性，這種酶能夠水解蛋白質(zhì)N端的蛋氨酸，是細胞內(nèi)一種十分重要的蛋白降解和修復(fù)相關(guān)的酶[34]。Giacobino等在阿根廷中東部的研究表明，施用煙曲霉素降低了蜂群N. ceranae的感染水平，但與對照組相比，在蜂群群勢上卻沒有改善作用[33]，所以關(guān)于煙曲霉素的效果仍有待系統(tǒng)評估。然而，煙曲霉素作為一種抗生素，在防治蜜蜂孢子蟲病的同時，會對蜂產(chǎn)品造成污染，因而在歐洲很多國家和地區(qū)是被禁止使用的。我國相關(guān)法規(guī)并未涉及煙曲霉素的使用方法和殘留限量，且目前我國市場還沒有煙曲霉素的供應(yīng)。

因此，我們要尋找相對溫和、無污染且能夠高效治療蜜蜂孢子蟲病的方法。已有研究的幾種方法包括有機酸防治、基因水平防治、營養(yǎng)防治、天然化合物防治和微生物防治等。

2.1 有機酸防治

0.25 M的草酸糖漿溶液在實驗室條件下能顯著降低N. ceranae孢子數(shù)量，蜂群實驗中，能顯著降低蜜蜂感染率[35]，這種效果對預(yù)防蜂群微孢子蟲感染極為顯著，因此草酸可能是一種十分有效的蜂群孢子蟲病的預(yù)防藥物。養(yǎng)蜂生產(chǎn)中，有蜂農(nóng)利用檸檬酸混合糖漿飼喂蜂群來防治蜜蜂孢子蟲病，但目前尚無相關(guān)文獻的數(shù)據(jù)支持。

2.2 基因水平防治

除了使用藥物以外，單純從抑制微孢子蟲的繁殖而言，利用基因水平防治的效果也不錯。Li等研究發(fā)現(xiàn)，受N. ceranae感染后，蜜蜂Wnt信號通路的抑制基因nake cuticle (nkd)表達上調(diào)，從而抑制蜜蜂的免疫，而采用RNAi的方法沉默蜜蜂的nkd基因表達后，蜜蜂的免疫功能上調(diào)且N. ceranae感染水平降低[36]。

2.3 營養(yǎng)水平防治

Basualdo等在蜂糧中加入了白蛋白和啤酒酵母，提高了蜂糧的營養(yǎng)成分，隨后發(fā)現(xiàn)取食了這種飼料的蜜蜂，其血清中的蛋白含量明顯提高，在感染N.ceranae后，存活率也有所提高[37]。這一研究說明，蜂群本身的營養(yǎng)水平有利于抵抗微孢子蟲的感染，這也能解釋為何在大流蜜期蜂群的患病程度相對較低。蜜蜂的免疫系統(tǒng)是對抗外來病原微生物最好的防御機制，因此對免疫系統(tǒng)的強化和刺激能夠達到抵抗微孢子蟲感染的預(yù)防效果。

2.4 天然化合物防治

蜜蜂服食由櫟樹皮提取物制成的“Nozevit”后，腸腔會覆蓋一層密實的單寧，起到預(yù)防和治療蜜蜂孢子蟲病的作用。施藥后，N. ceranae的孢子數(shù)量降低，蜂群封蓋子數(shù)顯著增加[38,39]。Maistrello等在糖塊或糖漿中分別加入百里香酚（100 ppm）和白藜蘆醇（10 ppm），飼喂給接種過N. ceranae孢子的蜜蜂，發(fā)現(xiàn)能夠顯著降低蜜蜂個體體內(nèi)的孢子數(shù)并且顯著延長蜜蜂存活時間[40,41]。1%濃度下的穿心蓮水煎劑、葡萄皮醇提取物以及黃柏水煎劑都能夠有效抑制孢子增殖，且7%穿心蓮水煎劑能夠顯著提高感染N.ceranae的蜜蜂存活率，有助于蜜蜂腸道組織修復(fù)[42]。

2.5 微生物防治

腸道微生物是生物體內(nèi)不可或缺的一種生物群體，它們能夠協(xié)助宿主進行食物代謝，如對糖類的吸收、纖維素的降解和脂類化合物的儲存和轉(zhuǎn)化等[43-45]，也能通過刺激的方式提高宿主免疫系統(tǒng)的活性，抵抗病原生物的入侵[46]。再者，大部分腸道共生菌都有其獨特的代謝產(chǎn)物，這些化合物除了能夠協(xié)助宿主降解食物中的有害成分[47,48]、改變激素代謝水平[49]以外，可能還具有抗菌活性。從蜜蜂腸道中分離的芽孢桿菌屬(Bacillus)和腸球菌屬(Enterococcus)的細菌，經(jīng)鑒定能夠分泌細菌素(bacteriocin)，這些細菌素對宿主本身并沒有顯著的毒性，但使用它們處理N. ceranae后，發(fā)現(xiàn)其感染率明顯下降[50]。乳酸菌（Lactobacillus）是蜜蜂腸道中十分常見的益生菌，飼喂約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)分泌的有機酸能夠提高蜜蜂個體體內(nèi)脂肪體的數(shù)量，提高煙曲霉素對微孢子蟲的作用能力，增強蜂群的群勢，同樣作為益生菌的雙歧桿菌（Biベdobacterium）也被發(fā)現(xiàn)能夠降低N. ceranae對蜜蜂的侵染能力[51,52]。因此，微生物防治也是一種防治蜜蜂孢子蟲病的重要途徑。

另外，還有一些特殊的材料也能夠抑制微孢子蟲的侵染能力或繁殖能力，如Roussel等研究了10種海藻硫酸多糖的抗微孢子蟲活性，發(fā)現(xiàn)分離自Porphyridium spp.的兩種多糖對蜜蜂無毒，且其中一種能降低孢子感染水平和蜜蜂死亡率[53]。殼聚糖和肽聚糖能夠顯著減少孢子數(shù)量并改變抗菌肽基因的表達，刺激蜜蜂采集行為和延長受感染蜜蜂的壽命[54]。

但要注意的是，某些藥物雖然能夠相對有效地抑制微孢子蟲的繁殖，但其用量也需要慎重控制，用量過高可能會造成對宿主的毒害作用，而用量過低則又可能造成病情的惡化。研究發(fā)現(xiàn)，煙曲霉素的作用與其用量有關(guān)，低劑量煙曲霉素的使用甚至?xí){(diào)節(jié)蜜蜂中腸的代謝水平，導(dǎo)致其內(nèi)N. ceranae的增殖速度加快[55]。鼠李糖桿菌(Lactobacillus rhamnosus)分泌的益生素在濃度控制不當(dāng)?shù)臈l件下會導(dǎo)致蜜蜂體內(nèi)酚氧化酶活性的降低，反而促使其體內(nèi)N. ceranae數(shù)量顯著增多(對照組的25倍)[56]。由此可見，雖然一些化合物和共生菌能夠有效抑制微孢子蟲的侵染和繁殖，但在利用它們進行預(yù)防和治療時，需要慎重考慮使用量，否則會適得其反。

此外，加強蜂群的飼養(yǎng)管理也有利于預(yù)防蜜蜂孢子蟲病。這些措施包括：選擇地勢高、陽光充足的場所，保持蜂箱內(nèi)的干爽；減少開箱次數(shù)，防止對蜜蜂造成過多干擾；保證優(yōu)質(zhì)的飼料；到位的蜂場清潔工作。

3 結(jié)語

（1） 目前蜜蜂孢子蟲病的檢測技術(shù)日趨成熟，通過簡單的鏡檢法即可判斷蜂群患病與否，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，可以同時對大量樣品進行檢測，簡單且快速；對樣品的孢子進行定量，可以獲得蜜蜂體內(nèi)或蜂產(chǎn)品感染的程度，方便進一步制定適宜的防治方案。免疫學(xué)的檢測由于容易產(chǎn)生非特異性反應(yīng)，還需進一步改進。

（2） 由于蜜蜂生產(chǎn)蜂產(chǎn)品的特性，養(yǎng)蜂生產(chǎn)上用藥受到嚴格的限制。煙曲霉素是在美國和加拿大等少數(shù)國家被允許用于防治蜜蜂孢子蟲病的合法藥物，但在抑制N. ceranae孢子增殖的同時對蜜蜂健康造成傷害，我國市場也沒有煙曲霉素的供應(yīng)，因此尋找綠色、高效的防治方法是我們關(guān)注的重點。近年來，在實驗室條件下的研究中找到了多種適宜的方法，能夠有效抑制N. ceranae孢子的增殖，但蜂群實驗卻涉及甚少，亟需進一步研究。而諸如醋酸、檸檬酸等生產(chǎn)上常用的防治物質(zhì)仍需要進一步的實驗驗證。

（3） 由于缺乏適宜的體外培養(yǎng)條件和蜜蜂細胞系，許多防治孢子蟲病的實驗機制仍未清楚，且微孢子蟲不能脫離蜜蜂個體，即使選擇健康蜂群用于實驗，也很難避免蜜蜂隱性攜帶其他病原帶來的誤差。因此，探究微孢子蟲體外生長且成功增殖的培養(yǎng)體系也是今后研究的重要工作之一。

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