陳銘勇 顧偉 李順清

摘要：目的 建立冠心益壽丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用TLC法對(duì)方中丹參、白芍、葛根進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC法對(duì)丹參酮ⅡA、葛根素的含量進(jìn)行測定。結(jié)果 該制劑中的丹參、白芍、葛根均可用TLC法檢出，且空白無干擾；含量測定的陰性對(duì)照無干擾，且穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性等指標(biāo)均符合含量測定的要求。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可作為冠心益壽丸的質(zhì)量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞：冠心益壽丸；薄層鑒別；含量測定

中圖分類號(hào)：R927 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2018）11-0074-05

冠心益壽丸為本院臨床應(yīng)用20余年的院內(nèi)制劑，主要由丹參、白芍、葛根等十余味藥材組成，以益氣化瘀為主，對(duì)治療冠脈介入術(shù)后再狹窄具有顯著療效[1]。為將其更好地開發(fā)應(yīng)用，前期研究已將冠心益壽丸由大蜜丸改進(jìn)為體積更小、攜帶服用更加方便的濃縮丸并對(duì)其提取工藝進(jìn)行了研究[2]。但前期研究并未建立冠心益壽丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為了有效控制其內(nèi)在質(zhì)量，本文建立了丹參、白芍、葛根的薄層色譜鑒別方法，并采用高效液相色譜法對(duì)丹參酮ⅡA、葛根素的含量進(jìn)行測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（包括四元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，二極管陣列檢測器，柱溫箱，型號(hào)：UltiMate3000，DIONEX，U.S）；色譜柱C18（4.6 mm×250 mm，5μm，S/N：0J7U73，Kromat Universil）；超聲儀（型號(hào)：SK3300LH，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；分析天平（型號(hào)：AB265-SMETTLER TOLEDO，Switzerland，0.00001 g）

1.2 試藥 冠心益壽丸（小試樣品，批號(hào)：170501，170502，170601），芍藥苷對(duì)照品（美侖生物技術(shù)有限公司，供含量測定用，批號(hào)：J0516AS），丹參酮ⅡA對(duì)照品（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，供含量測定用，批號(hào)：PRF7052541）；葛根素（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，供含量測定用，批號(hào)：16032508）。甲醇、乙腈為色譜純，其余所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 白芍薄層鑒別 白芍為本品重要組成成分，芍藥苷為其特征成分，參照《中國藥典》[3]2015版一部，以芍藥苷做對(duì)照品，采用TLC鑒別白芍，方法和結(jié)果如下：取冠心益壽丸2 g，研碎，加乙醇，超聲處理5 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖际谷芙猓鳛楣谛囊鎵弁璧墓┰嚻啡芤?。取缺白芍的陰性冠心益壽丸，同法制得缺白芍的陰性樣品溶液。取白芍粉?.5 g，加乙醇10 mL，振搖5 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為對(duì)照藥材的溶液。取芍藥苷對(duì)照品，加乙醇制成每lmL含lmg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40：5：10：0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同的顏色斑點(diǎn)。而缺白芍的陰性樣品色譜處無此斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1。

2.1.2 丹參薄層鑒別 丹參本品主藥之一，主要含有丹參酮Ⅰ，丹參酮ⅡA，隱丹參酮等成分，其中丹參酮ⅡA為其特征成分，參照《中國藥典》[3]2015版一部，以丹參酮ⅡA做對(duì)照品，采用TLC鑒別丹參，方法和結(jié)果如下：取冠心益壽丸粉末2 g，加乙醇10 mL，超聲處理15 min，離心，取上清液作為供試品溶液。取缺丹參的陰性冠心益壽丸，同法制得缺丹參的陰性樣品溶液。取丹參對(duì)照藥材1 g，加乙醇5 mL，超聲處理15 min，離心，取上清液作為對(duì)照藥材溶液。取丹參酮ⅡA對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述溶液，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（7：3）為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同的顏色斑點(diǎn)。而缺丹參的陰性樣品色譜處無此斑點(diǎn)。結(jié)果見圖2。

2.1.3 葛根薄層鑒別 葛根素為葛根特征性成分，參照《中國藥典》[3]2015版一部，以葛根素做對(duì)照品，采用TLC鑒別葛根，方法和結(jié)果如下：取冠心益壽丸粉末2 g，研碎，加甲醇20 mL，放置2h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取缺葛根的陰性冠心益壽丸，同法制得缺葛根的陰性樣品溶液。取葛根粉末2 g，研碎，加甲醇20 mL，放置2h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對(duì)照藥材的溶液。取葛根素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述溶液，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水（7：2.5：0.25）為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。而缺葛根的陰性樣品色譜處無此斑點(diǎn)。結(jié)果見圖3。

2.2 含量測定 丹參、葛根均為冠心益壽丸主藥，在提取中分別采用醇提及水提的提取方法。其中丹參中丹參酮ⅡA、葛根中的葛根素含量可作為檢驗(yàn)濃縮提取工藝的重要指標(biāo)。

2.2.1 丹參酮ⅡA含量的測定

2.2.1.1 溶液配制

對(duì)照品溶液的制備：取丹參酮ⅡA對(duì)照品，精密稱定為0.0032 g，加甲醇定容到10 mL棕色容量瓶中，采用倍半稀釋法將對(duì)照品濃度稀釋一倍，最終制得每1 mL含丹參酮ⅡA對(duì)照品0.16 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

供試品溶液的制備：取冠心益壽丸粉末2 g，精密稱定，加甲醇10 mL，用封口膜封口后放置2h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

陰性供試品的制備：取缺少丹參的冠心益壽丸粉末2 g，精密稱定，加甲醇10 mL，用封口膜封口后放置2h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為陰性供試品溶液。

2.2.1.2 色譜條件 色譜柱：C18（4.6 mm×250 mm，5μm，S/N：0J7U73，Kromat Universil）；柱溫：30℃，流動(dòng)相：甲醇：0.1%磷酸水=85：15；檢測波長：270nm；流速：0.9 mL/min。分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定。色譜圖見圖4（a）、圖4（b）和圖4（c）。

結(jié)果表明：供試品中丹參酮ⅡA與其前后峰的分離度、拖尾因子均能滿足《中國藥典》2015版高效液相色譜法項(xiàng)下規(guī)定，陰性對(duì)照品的色譜圖在與對(duì)照品相同保留時(shí)間位置上沒有吸收峰，說明該制劑中其他藥物對(duì)丹參酮ⅡA的含量測定干擾很小，用本法測定其含量專屬性較強(qiáng)、靈敏度高。

2.2.1.3 線性與范圍 將上述制得丹參酮ⅡA對(duì)照品稀釋100倍后，分別精密吸取對(duì)照品溶液2、4、8、10、12、14、16μL注入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積值為縱坐標(biāo)，以丹參酮ⅡA進(jìn)樣量（μL）為橫坐標(biāo)，作線性回歸，得回歸方程：y=1.1472x-0.02836，結(jié)果表明丹參酮ⅡA在0.32～2.56 mg之間呈良好線性關(guān)系。

2.2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取任意一批冠心益壽丸供試品溶液分別于0h、1h、2h、6h、12h、24h進(jìn)行測定。每次進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示RSD值為0.79%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取任意一批冠心益壽丸供試品，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10μL，記錄丹參酮ⅡA峰面積，計(jì)算結(jié)果顯示RSD值為0.21%，表明重復(fù)性良好。

2.2.1.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 稱取份同一批號(hào)已知丹參酮ⅡA含量的研細(xì)的冠心益壽丸6份。每份約2 g，精密稱定，精密稱取丹參酮ⅡA對(duì)照品0.0032 g，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，倍半稀釋法稀釋一倍，濃度為0.1600 mg/mL，分別精密吸取1.5 mL加入6個(gè)樣品中。精密吸取10μL，按“2.2.1.2”項(xiàng)下的方法測定峰面積，計(jì)算丹參酮ⅡA回收率。丹參酮ⅡA的平均回收率為101.15%，RSD為3.58%，結(jié)果見表1。加樣回收率=（測得量-樣品含量）/標(biāo)準(zhǔn)品加入量×100%。

2.2.1.7 冠心益壽丸中丹參酮ⅡA含量測定 稱取不同批次冠心益壽丸粉末，每份約2 g，精密稱定，按“2.2.1.1”項(xiàng)下同法制備成供試品溶液，分別精密吸取10μL注入色譜儀，記錄丹參酮ⅡA峰面積，并計(jì)算丹參酮ⅡA含量。結(jié)果見表2。

根據(jù)七批樣品的測定結(jié)果，七批樣品丹參酮ⅡA平均含量為0.2538 mg/g。初步擬定丹參酮ⅡA應(yīng)不低于平均含量的 85%，即規(guī)定本品丹參以丹參酮ⅡA計(jì)不得少于0.22 mg/g。

2.2.2 葛根素含量測定[4]

2.2.2.1 溶液配制

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取葛根素對(duì)照品0.0040 g于25 mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，最終制得每1 mL含葛根素對(duì)照品0.16 mg的溶液作為對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

供試品溶液的制備：取冠心益壽丸粉末2 g，精密稱定，加甲醇10 mL，放置2小時(shí)，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

陰性供試品的制備：取缺少葛根的冠心益壽丸粉末2 g，精密稱定，加甲醇10 mL，用封口膜封口后放置2h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為陰性供試品溶液。

2.2.2.2 色譜條件 色譜柱：C18（4.6 mm×250 mm 5μm，S/N：0J7U73，Kromat Universil）；柱溫：30℃，流動(dòng)相：甲醇：水=25：75；檢測波長：270nm；流速：0.9 mL/min。分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定。分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定。色譜圖見圖5（a）、圖5（b）和圖5（c）。

結(jié)果表明：供試品中葛根素與其前后峰的分離度、拖尾因子均能滿足《中國藥典》2015版高效液相色譜法項(xiàng)下規(guī)定。陰性對(duì)照品有輕微干擾，但由于峰形和峰面積與對(duì)照品完全不同，故可以認(rèn)為其他藥物對(duì)葛根素的含量測定沒有干擾，用本法測定葛根素的含量專屬性較強(qiáng)、靈敏度較高。

2.2.2.3 線性與范圍 分別精密吸取葛根素對(duì)照品溶液4、8、10、12、14、16、22、24 μL注入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件測定峰面積。以峰面積值為縱坐標(biāo)，以葛根素進(jìn)樣量（μL）為橫坐標(biāo)，作線性回歸，得回歸方程：y=4.2318x-2.692，結(jié)果表明葛根素在0.64～3.84 mg之間呈良好線性關(guān)系。

2.2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取一批冠心益壽丸供試品溶液分別于0、1、2、6、12、24 h進(jìn)行測定，每次進(jìn)樣10 μL，記錄葛根素峰面積，計(jì)算RSD值。RSD值為0.71%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批冠心益壽丸粉末，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，記錄葛根素峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示RSD為0.92%，表明重復(fù)性良好。

2.2.2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 稱取同一批號(hào)已知葛根素含量的研細(xì)的冠心益壽丸6份，每份約2 g，精密稱定，精密稱取葛根素對(duì)照品0.0020 g，置于25 mL容量瓶中，濃度為0.0800 mg/mL，分別精密吸取3 mL加入6個(gè)樣品中。精密吸取10 μL，按“2.4.3.1”項(xiàng)下的方法測定峰面積，計(jì)算葛根素回收率。葛根素的平均回收率為99.45%，RSD為1.51%，結(jié)果見表3。加樣回收率=（測得量-樣品含量）/標(biāo)準(zhǔn)品加入量×100%。

2.2.2.7 冠心益壽丸中葛根素的含量測定 稱取不同批次冠心益壽丸粉末，每份約2 g，精密稱定，按“2.2.2.2”項(xiàng)下同法制備成供試品溶液，分別精密吸取10 μL注入色譜儀，記錄葛根素峰面積，并計(jì)算葛根素含量。結(jié)果見表4。

根據(jù)七批樣品的測定結(jié)果，七批樣品葛根素平均含量為2.4304 mg/g。初步擬定葛根素應(yīng)不低于平均含量的85%，即規(guī)定本品丹參以葛根素計(jì)不得少于2.07 mg/g。

3 小結(jié)與討論

在白芍的定性鑒別過程中，通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)宋喜臣[5]采用“取樣品2.0 g，加乙醇25 mL，加熱回流3h，加乙醇溶解”的方法制得供試品溶液。通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)乙醇超聲亦能取得類似的提取率，且超聲提取在具有實(shí)驗(yàn)周期短、操作簡便的方法，故而最終確定采用乙醇超聲的方法對(duì)供試品進(jìn)行提取。

在丹參的定性鑒別過程中，查閱文獻(xiàn)得知張淑瑜[6]采用乙醚超聲提取，羅紅麗[7]采用乙醚振搖放置提取。但經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙醇超聲提取同樣具有良好的效果，故供試品采用超聲提取法制備。在展開系統(tǒng)的選擇中，通過對(duì)比《中國藥典》和王潤梅等[8]的展開系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)王潤梅的展開系統(tǒng)更適用于冠心益壽丸。

在定量測定中，分別選取水提和醇提部分的代表性藥物丹參及葛根進(jìn)行含量測定。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明，二者的含量測定方法穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)，適用于冠心益壽丸的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)：

[1]曹東，來圣吉，來圣麗，等.冠心益壽丸治療冠心病318 例療效總結(jié)[J].云南中醫(yī)中藥雜志，1995，16（6）：32-33.

[2]陳銘勇，顧偉，車京梅，等.冠心益壽丸（濃縮丸）的提取工藝研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2016，37（10）：75-77.

[3]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[4]李鐵強(qiáng)，肖楠.高效液相色譜法測定消渴平膠囊中葛根素含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，29（11）：1495-1496.

[5]宋喜臣.保肝丸制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[D].吉林大學(xué)，2014.

[6]張淑瑜.復(fù)方漢防己顆粒中丹參酮ⅡA的成分鑒別和含量測定[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2013，（3）：228-230.

[7]羅紅麗.丹參藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[D].成都中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[8]王潤梅，岳志勁.丹參中丹參酮的提取及其薄層色譜定性分析[J].山西大同大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，（1）：32-40.

（收稿日期：2018-08-09）