劉 丹 Dan 劉劍利 - 王 帥 曹向宇 -

(遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036)

高粱(Sorghum)又稱烏禾、蘆，屬于禾本科高粱屬，一年生的草本植物，與玉米、水稻和小麥稱為四大糧食作物[1]，也是一種主要的釀造原料，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]。高粱含有較多的多酚和高粱蠟[3]，還含有大量的原花青素[4]，具有良好的抗氧化、抗腫瘤、延緩衰老等多種功能，現(xiàn)已在醫(yī)學(xué)和化工領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。隨著高粱中一些有益于健康的功能成分不斷被發(fā)掘，高粱的研究與開(kāi)發(fā)越來(lái)越受到人們的關(guān)注[3]。

醇溶蛋白是谷物主要的儲(chǔ)存蛋白，在一些工業(yè)生產(chǎn)的副產(chǎn)物中，醇溶蛋白和谷蛋白的蛋白質(zhì)含量約是全籽粒含量的3倍[5]，但是這類副產(chǎn)物加工利用率很低。對(duì)其進(jìn)行深加工，制備醇溶蛋白，既有利于資源的循環(huán)利用，又能產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)收益[6]。醇溶蛋白含豐富的谷氨酰胺和脯氨酸，缺乏帶電氨基酸殘基[7]，這些性質(zhì)使其具有良好的彈性、成形性、高韌性、生物降解能力和生物相容性[8]。醇溶蛋白約占高粱總蛋白的70%～90%，是主要的貯藏蛋白[9]，對(duì)高粱蛋白質(zhì)的生化和營(yíng)養(yǎng)水平有著至關(guān)重要的影響[10]。

目前，高粱醇溶蛋白提取比較常用的方法包括有機(jī)溶劑提取法[11]、臨界CO2萃取技術(shù)[12]、超聲波溶劑提取法[13]等，但普遍存在蛋白質(zhì)提取率偏低的問(wèn)題，而且溶劑提取法使用的溶劑大多有毒、用量較大、回收麻煩，臨界CO2萃取技術(shù)設(shè)備比較昂貴、生產(chǎn)成本較高[14]。因此尋求生產(chǎn)成本較低的、蛋白提取率高的方法，對(duì)于高粱醇溶蛋白開(kāi)發(fā)具有重要意義。超聲波法利用超聲波動(dòng)形式破壞組織，促進(jìn)溶劑的穿透作用，提高有效成分的提取率[15-16]。堿性蛋白酶水解能力較優(yōu)，蛋白質(zhì)經(jīng)水解后品質(zhì)得到改善，溶解性明顯提高，提取率顯著上升[17]。本試驗(yàn)擬利用超聲輔助酶法制備高粱醇溶蛋白，探索蛋白提取率相對(duì)較高的制備工藝，并對(duì)蛋白的功能特性進(jìn)行研究，以期為高粱的綜合利用與開(kāi)發(fā)提供一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

高粱：遼雜18號(hào)，市售；

堿性蛋白酶：酶活力20 000 U/g，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

牛血清白蛋白：純度>96%，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外分光光度計(jì)：UV-2700型，島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司；

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：SCIENTZ-IID型，冠森生物上海公司。

1.2 方法

1.2.1 高粱醇溶蛋白的提取 高粱粉碎，過(guò)120目篩備用；采用超聲輔助酶法提取高粱醇溶蛋白[18]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)曲線測(cè)定 參照文獻(xiàn)[19]。595 nm處測(cè)定蛋白溶液吸光值(OD值)，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 單因素試驗(yàn)方案 通過(guò)對(duì)影響蛋白提取的多個(gè)單因素進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，選定對(duì)提取率影響較大的4個(gè)因素，以高粱醇溶蛋白的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行試驗(yàn)。

(1) 乙醇濃度的選擇：固定料液比1∶10 (g/mL)，加酶量1%，pH 12，水浴溫度55 ℃，酶作用時(shí)間3 h，超聲功率200 W，超聲時(shí)間20 min，分別考察乙醇濃度為50%，60%，70%，80%，90%時(shí)的高粱醇溶蛋白提取率。

(2) 酶作用時(shí)間的選擇：固定料液比1∶10 (g/mL)，加酶量1%，pH 12，乙醇濃度60%，水浴溫度55 ℃，超聲功率200 W，超聲時(shí)間20 min，分別考察酶作用時(shí)間為1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h時(shí)的高粱醇溶蛋白提取率。

(3) 加酶量的選擇：固定料液比1∶10 (g/mL)，pH 12，水浴溫度55 ℃，乙醇濃度60%，酶作用時(shí)間3 h，超聲功率200 W，超聲時(shí)間20 min，分別考察加酶量為0.5%，1%，2%，3%，4%時(shí)的高粱醇溶蛋白提取率。

(4) 超聲時(shí)間的選擇：固定料液比1∶10 (g/mL)，加酶量1%，pH 12，乙醇濃度60%，水浴溫度55 ℃，酶作用時(shí)間3 h，超聲功率200 W，分別考察超聲時(shí)間為5，10，20，30，40 min 時(shí)的高粱醇溶蛋白提取率。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，在單因素的基礎(chǔ)上，選取對(duì)高粱醇溶蛋白影響顯著的4個(gè)因素，采用四因素三水平的組合設(shè)計(jì)，以高粱醇溶蛋白提取率為指標(biāo)優(yōu)化提取工藝參數(shù)[20]。

1.2.5 靜置溫度和時(shí)間對(duì)高梁醇溶蛋白持油性與持水性的影響 稱取1 g高粱醇溶蛋白，加入5 mL色拉油(蒸餾水)充分混勻，靜置溫度分別為15，25，35，45，55，65 ℃，靜置時(shí)間分別為10，20，30，40，50，60 min，靜置結(jié)束后5 000 r/min離心15 min，分別考察靜置溫度和時(shí)間對(duì)持油性與持水性的影響。醇溶蛋白持油性(持水性)按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

R——持油性(持水性)，g/g；

m1——樣品蛋白質(zhì)量，g;

m2——離心后沉淀質(zhì)量，g。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

如圖1所示，蛋白質(zhì)含量與其在595 nm處的吸光度值呈良好的相關(guān)性，其中R2=0.991 5，符合測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)公式y(tǒng)=0.009 1x+0.054可計(jì)算出提取液中蛋白質(zhì)含量。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對(duì)提取率的影響 由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)高粱醇溶蛋白的得率達(dá)到峰值，之后得率逐漸減小?？赡苁且掖紳舛容^高引起部分蛋白變性，導(dǎo)致蛋白粒子聚集從而使部分蛋白以聚集粒子的形式被離心分離，降低了蛋白提取率[21]。故確定乙醇濃度單因素最佳條件為60%。

圖2 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

2.2.2 酶作用時(shí)間對(duì)提取率的影響 由圖3可知，3 h時(shí)高粱醇溶蛋白提取率最大，之后提取率呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)榉磻?yīng)前期底物濃度、酶活性較高，提取率上升較快；但隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，反應(yīng)產(chǎn)物的積累抑制了酶的活力，同時(shí)部分溶出蛋白質(zhì)被水解，導(dǎo)致蛋白提取率下降[22]。因此選取3 h作為酶最佳作用時(shí)間。

2.2.3 加酶量對(duì)提取率的影響 由圖4可知，加酶量為0.5%～1.0%時(shí)，高粱醇溶蛋白提取率明顯增大，并在1%時(shí)達(dá)到最大值，之后提高酶的添加量，得率逐漸降低。

圖3 酶作用時(shí)間對(duì)提取率的影響

圖4 加酶量對(duì)提取率的影響

圖5 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.2.4 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響 由圖5可知，超聲時(shí)間為5～20 min時(shí)，提取率逐漸上升，20 min時(shí)達(dá)到最大值。在董紅敏等[23]的試驗(yàn)中也得到相似的結(jié)果，原因是隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白提取率逐漸增加，但超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響蛋白質(zhì)的活性，導(dǎo)致蛋白的提取率下降。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

以得到的單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到高粱醇溶蛋白提取的響應(yīng)面因素設(shè)計(jì)水平，見(jiàn)表1。

通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)得到數(shù)據(jù)，具體見(jiàn)表2。

2.4 回歸模型方差分析

用軟件設(shè)計(jì)Design-Expert 8.0.6.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得各因素的二元多項(xiàng)回歸方程：

Y=7.29-0.035×A+0.048×B+0.032×C-0.024×D+0.027×AB+0.055×AC-0.023×AD-0.002 088×BC-0.035×BD-0.006 675×CD-0.17×A2-0.15×B2-0.19×C2-0.17×D2。

(2)

表1 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

2.5 雙因素交互作用分析

各因素交互作用對(duì)得率的影響見(jiàn)圖6。曲線越陡峭，說(shuō)明該因素對(duì)蛋白得率影響越大[24]。從等高線的形狀也能看出交互效應(yīng)的大小，等高線呈圓形，表示兩因素交互作用不顯著；呈橢圓型或者馬鞍形表示交互作用顯著[25]。根據(jù)三維曲面圖可看出，加酶量在0.9%～1.3%的范圍內(nèi)對(duì)蛋白提取率最優(yōu)；當(dāng)酶作用時(shí)間在2.7～3.1 h時(shí)提取率最佳；最適的乙醇濃度為59%～63%；最適的超聲時(shí)間為18～22 min，與單因素結(jié)果相符。同時(shí)也可看出對(duì)醇溶蛋白提取率影響最大的因素為加酶量，其他因素次之，表3回歸分析結(jié)果也與此相吻合，且各項(xiàng)單因素對(duì)應(yīng)的P值<0.01，皆達(dá)到極顯著水平。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件得到高粱醇溶蛋白的最佳提取條件為：加酶量1.08%、酶作用時(shí)間2.96 h、乙醇濃度60.76%和超聲波作用時(shí)間19.17 min，在此條件下醇溶蛋白的理論提取率為7.29%。考慮到實(shí)際操作中遇到問(wèn)題，將此工藝修整為：加酶量1%、酶作用時(shí)間3 h、乙醇濃度60%和超聲波作用時(shí)間19 min，經(jīng)多次試驗(yàn)后，得出蛋白得率為(7.19±0.36)%，理論值與試驗(yàn)值基本吻合，證實(shí)試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠。

2.7 靜置溫度和時(shí)間對(duì)高粱醇溶蛋白持油性與持水性的影響

2.7.1 靜置溫度對(duì)持油性與持水性的影響 由圖7所示，溫度變化范圍為15～65 ℃時(shí)，持油性呈現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢(shì)。在35 ℃得到峰值，之后隨著溫度繼續(xù)上升，持油性下降。這是由于溫度的升高，加強(qiáng)了油的流動(dòng)性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，降低了蛋白質(zhì)與油之間的相互作用[26]。持水性在15～35 ℃時(shí)迅速增大，在溫度為35 ℃時(shí)，醇溶蛋白持水性達(dá)到頂峰，當(dāng)溫度在35～65 ℃時(shí)，持水性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這是因?yàn)榈蜏丨h(huán)境下，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化較松散，溫度上升后加速蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子與水分子的之間相互作用[27]；但是當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的許多非極性基團(tuán)顯露出來(lái)，削弱了蛋白質(zhì)與水之間的相互作用。

2.7.2 靜置時(shí)間對(duì)持油性與持水性的影響 由圖8可知，高粱醇溶蛋白持油性隨著靜置時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后平穩(wěn)的趨勢(shì)，在40 min時(shí)持油性達(dá)到最大值。因?yàn)楫?dāng)時(shí)間達(dá)到40～50 min時(shí)，高粱醇溶蛋白因?yàn)椴煌睦砘c結(jié)構(gòu)特性導(dǎo)致蛋白質(zhì)的持油性達(dá)到了飽和狀態(tài)，當(dāng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，蛋白質(zhì)的持油性不再增加[28]。高粱醇溶蛋白持水性隨著靜置時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步加大，持水性在靜置40 min時(shí)達(dá)到頂峰，可能是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，水在蛋白中能夠更加均衡分布，因此持水性上升[29]。超過(guò)40 min后，持水性上升趨勢(shì)減弱，達(dá)到飽和狀態(tài)，趨于穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)加酶量、酶作用時(shí)間、乙醇濃度和超聲波時(shí)間4個(gè)因素的探究，建立了影響高粱醇溶蛋白提取率的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化得出高粱醇溶蛋白超聲輔助酶法提取的最佳工藝條件為：加酶量1%、酶作用時(shí)間3 h、乙醇濃度60%、超聲波作用時(shí)間19 min。該條件下蛋白得率為(7.19±0.36)%。通過(guò)對(duì)高粱醇溶蛋白功能特性的檢測(cè)得出，在靜置時(shí)間40 min和溫度為35 ℃條件下時(shí)，其持油性最大值為(2.84±0.15) g/g，持水性最大值為(2.78±0.09) g/g。超聲輔助酶法制備高粱醇溶蛋白是一種較優(yōu)的方法，增加了醇溶蛋白的提取率，本試驗(yàn)提取率比劉振春[3]超聲波協(xié)同微波提取法高5.89%。今后將對(duì)高粱醇溶蛋白的功能特性進(jìn)行全面研究，使其更適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，為高粱深加工及其新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)與利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析?

? **表示差異極顯著(P<0.01)；*表示差異顯著(P<0.05)。

圖6 加酶量和酶作用時(shí)間、乙醇濃度和酶作用時(shí)間、酶作用時(shí)間和超聲時(shí)間、加酶量和超聲時(shí)間相互作用

Figure 6 Response surface and contour plots for the effects of interaction between Enzyme dosage and Hydrolysis time, Ethanol concentration and enzyme action time, Enzyme action time and ultrasound time, Enzyme dose and ultrasound time

圖7 靜置溫度對(duì)持油性和持水性的影響

圖8 靜置時(shí)間對(duì)持油性和持水性的影響

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