, , , , , * (. 中國食品藥品檢定研究院, 北京 00050; . 遼寧省食品檢驗檢測院, 沈陽 005)

在日常監(jiān)管中,食品理化檢驗主要包括質量檢驗和安全性檢驗,其中質量檢驗主要針對的是食品中品質指標、污染物指標和帶入或者工藝衍生的風險性指標;安全檢驗主要針對的是食品中可能存在的風險物質、超范圍添加成分和非食用物質等方面的內容。兩類檢驗均存在檢測指標分布不均一、檢測濃度范圍寬泛、檢測對象多樣、目標物質存在基體多樣性等特點。通常食品檢測的不確定度來源主要包含樣品預處理、樣品制備及樣品檢測等3個方面[1-3],其中樣品預處理及樣品制備也可以統(tǒng)一為樣品處理。研究[4-8]表明,食品分析中樣品處理和檢測分別帶入的不確定度占比中,樣品處理通常占有75%以上的份額,而樣品的檢測則只占有10%～20%的份額。隨著檢測設備的靈敏度和檢測能力的提高,來源于樣品檢測的不確定度逐步減小,影響食品檢測的主要不確定度來源為樣品處理。

樣品的制備技術[5-11]主要有液液萃取、液固萃取、固相萃取、定量轉化、消解等等,一般對于微量或者痕量成分,常采用富集或者濃縮的方式以提高其檢出效率,在檢測過程中存在物質或者溶劑轉移和替換等步驟,帶來的檢測目標損失包括吸附、分配、轉移、反應等方面的損失[12-15]。在現代樣品分析中,有研究[16-22]提出減少處理步驟和同一提取凈化體系等方式,以減少相關損失,提高回收率。本工作建立一種快速樣品制備方法,對樣品進行超細粉碎處理,添加溶劑進行提取,加入惰性陶瓷砂,以超細粉碎離心器進行離心粉碎后離心,將上清液轉移入裝有少量C18的進樣瓶外管中,混勻后,套入附有濾膜內管,直接過濾上機檢測。方法以高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定調味料中的5種罌粟堿殼成分為例,通過與常規(guī)樣品處理方法進行比較,來驗證方法的有效性。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

Waters XEVO TQ-S三重四極桿串聯(lián)質譜儀,配超高效液相色譜儀;Milli-Q型超純水儀;CF16RXⅡ型離心機;自制小型超細粉碎離心機。

標準儲備溶液:1.00 g·L-1,分別稱取鹽酸罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡和磷酸可待因對照品適量,用0.1%(體積分數,下同)甲酸的甲醇溶液溶解并稀釋配制而成。使用時,配制成罌粟堿、那可丁和蒂巴因的質量濃度為50 mg·L-1,嗎啡和磷酸可待因質量濃度為250 mg·L-1的混合標準溶液。

嗎啡-D3、可待因-D3內標溶液:5.0 mg·L-1,介質為甲醇。

鹽酸罌粟堿、嗎啡、那可丁、磷酸可待因、蒂巴因對照品。

乙腈、甲醇為色譜純;甲酸為質譜純;鹽酸、氫氧化鈉、乙酸鈉、甲酸銨、硫酸鎂為分析純;N-丙基乙二胺(PSA,粒度50～80 μm)、C18(粒度40～80 μm)填料。

1．2 儀器工作條件

1) 色譜條件 Waters BEH HILIC色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),柱溫40 ℃;進樣量5 μL;流量0.2 mL·min-1;流動相A為乙腈,B為含0.1%(體積分數,下同)甲酸溶液。梯度洗脫程序:0～0.5 min時,A為95%;0.5～2.5 min時,A由95%降至70%;2.6～4.0 min時,A為40%;4.0～6.0 min時,A為95%。

2) 質譜條件 電噴霧正離子源;多反應監(jiān)測(MRM)模式;毛細管電壓3.5 kV;離子源溫度150 ℃,去溶劑氣溫度400 ℃;去溶劑氣流量800 L·h-1;錐孔氣流量30 L·h-1;碰撞氣為氬氣,碰撞氣壓0.376 Pa。各物質的定性、定量離子及碰撞能量見表1。

表1 質譜條件Tab. 1 MS parameters

1．3 試驗方法

1．3．1 常規(guī)樣品前處理方法

稱取試樣2.000 0 g于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中,加入內標溶液150 μL,再加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液5 mL,超聲處理30 min,加入乙腈15 mL,渦旋振蕩1 min,加入無水硫酸鎂6 g和無水乙酸鈉1.5 g的混合粉末,迅速振搖,渦旋振蕩1 min,以5 000 r·min-1轉速離心5 min,取上清液待凈化。

稱取(50±5) mg的PSA、(100±5) mg的無水硫酸鎂、(100±5) mg的C18粉末置于2 mL聚四氟乙烯具塞離心管中,移取上清液1.5 mL至此離心管中,渦旋混合1 min,以10 000 r·min-1轉速離心2 min,移取上清液,經0.22 μm濾膜過濾,待測。

1．3．2 快速樣品制備方法

稱取試樣2.000 0 g于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中,加入內標溶液150 μL,加入含0.1%甲酸的乙腈5 mL,加入惰性陶瓷砂0.2 g,以超細離心粉碎器進行離心粉碎5 min,轉速為5 000 r·min-1。取出,以10 000 r·min-1轉速離心10 min,取上清液1.2 mL于已裝入0.1 g左右C18填料的進樣瓶外管中,混勻后,插入帶有濾膜的內插管,蓋好進樣瓶蓋,放入進樣器,待測。

2 結果與討論

2．1 快速制備樣品方法的建立

為更好地比較快速樣品制備方法,選擇的常規(guī)樣品處理方法為改良的QuEChERS技術,也屬于近年來較為流行用于快速前處理的方式。

快速樣品制備包括樣品的超細粉碎、提取、離心和過濾等幾個步驟,與常規(guī)方法不同的是,樣品提取經過與惰性陶瓷的碰撞摩擦,增加了樣品的粉碎和接觸程度。液體和固體樣品均采用相同的方式進行,其中液體樣品由于經過該步驟增加了相關物質的接觸,同時由于摩擦升高溫度,提高了提取效率。該制備方法采用的超細粉碎離心機,見圖1,后期采用的進樣瓶參見圖2。

圖1 超細粉碎離心機的構造簡圖Fig. 1 Structure diagram of the superfine crushing centrifuge

圖2 樣品瓶構造簡圖Fig. 2 Structure diagram of the vial

圖1所示的超細粉碎離心機主要對離心機內壁、離心轉子構造進行了設計:內壁采用聚四氟乙烯內面,均勻塑造成波浪式表面;離子轉子采用的桿型設計,套入離心管,離心時,管外端可以接觸到離心機內壁,在振蕩下,產生樣品和內置陶瓷砂的摩擦以粉碎樣品。圖2所示的樣品瓶主要按照現有1.5 mL或者2 mL進樣瓶進行了設計,包括內外兩個部分:外部套管可移入提取后的樣品溶液,管內可預先放置少量C18填料,用于樣品溶液的凈化,待溶液和少量填料混勻后,插入內管,內管的下部有0.22 μm尼龍濾膜,可以過濾溶液,插入后進入內管的溶液可以直接上機測定。

2．2 工作曲線、檢出限與測定下限

稱取陰性樣品2.000 g,加入內標溶液150 μL,再加入混合標準溶液,按試驗方法配制5種罌粟堿殼的基質標準溶液系列并進行測定,以罌粟堿、那可丁和蒂巴因的質量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標繪制工作曲線,以外標法定量;以嗎啡和可待因的峰面積與相應內標物峰面積的比值為縱坐標,嗎啡和可待因的質量濃度為橫坐標繪制工作曲線,以內標法定量。2種樣品制備方法得到的線性范圍和線性回歸方程見表2。

分別以3倍信噪比和10倍信噪比計算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),結果見表2。

表2 2種樣品制備方法得到的線性參數、檢出限及測定下限Tab. 2 Linearity parameters, detection limits and the lower limits of determination of the two methods for sample preparation

由表2可知:本法所得線性回歸方程的斜率明顯高于常規(guī)方法,同時回歸曲線的截距相當;比較測定下限和檢出限可知,本法比常規(guī)方法的靈敏度高。

2．3 精密度與回收試驗

在低、中、高等3個濃度水平進行加標回收試驗,加標回收率在75%以上。精密度包括日間和日內精密度,5種物質在6次平行測定下,相對標準偏差為5%～10%。說明本法可以滿足食品檢測的要求。

2．4 樣品分析

對市售的5批固體調味料和5批液體調味料進行檢測,按照常規(guī)樣品制備方法,固體調味料中檢出1批次的陽性樣品(罌粟堿),液體調味料中均為陰性樣品。而通過快速樣品制備方法后,5批固體樣品中檢出2批次陽性樣品(罌粟堿、嗎啡),液體樣品中檢出1批次陽性樣品(嗎啡)。對結果進行進一步分析,液體樣品的檢出主要是由于方法整體靈敏度的提高,而固體樣品中另外一批次樣品(嗎啡)的檢出,是由于在常規(guī)制備方法中固體樣品的粉碎程度不夠,沒有得到很好的提取。在進一步粉碎和超聲提取后沿用常規(guī)制備的方法進行檢測,發(fā)現可以檢出,但是測定值比快速樣品制備方法低,說明快速制備方法具有更好的適用性,減少了假陰性的檢測結果。

本工作提出了超細粉碎提取、簡單凈化的樣品前處理方法,可以用于部分食品樣品中風險物質的檢測。方法進一步減少了樣品的處理步驟和試劑的添加,減少了步驟中的轉移吸附損失,可以為食品風險物質的靈敏檢測提供途徑。

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