付作輝，李先倫，趙芹峰

（山東省嘉祥縣中醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 272400）

本研究通過(guò)觀察黃芪褻術(shù)湯在大鼠肝纖維化模型干預(yù)治療后肝功能、肝組織中纖維化血清標(biāo)志物透明質(zhì)酸的含量變化，評(píng)價(jià)其在抗肝纖維化中的作用。

1 材料與方法

1.1 藥物和主要試劑

黃芪褻術(shù)湯由生黃芪30 g，紅花10 g，褻術(shù)15 g，炒白術(shù)10 g，醋柴胡10 g，地鱉蟲(chóng)5 g，生甘草10 g，白礬5 g，組成。黃芪提取物的制備：粉碎用蒸餾水1000 mL，冷水浸泡24h后，加熱煮沸30 min，傾出上清液，以此方法煮沸共3次，合并3次上清液，小火濃縮至150 mL，制備藥液，待涼后用濾紙過(guò)濾，放人冰箱備用，臨用前配成所需濃度。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理

1.2.1 建立大鼠肝纖維化模型

輪替給雄性SD大鼠四肢內(nèi)側(cè)皮下注射四氯化碳植物油混合液，按0.3 mL/100g體重的劑量，每周注射兩次，連續(xù)注射后8周。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

取雄性SD肝纖維化模型大鼠40只，隨機(jī)分為2組，一組（實(shí)驗(yàn)組）給予黃芪褻術(shù)湯（協(xié)同方）灌胃，每天2次，每次10毫升，對(duì)照組給予NS同樣劑量灌胃，每天2次；灌胃8周后留取血清標(biāo)本，隨后處死大鼠，留取肝組織待檢。

1.2.3 肝功能檢測(cè)方法

取大鼠血清測(cè)定ALT、AST；肝纖維化：取大鼠血清用放免法測(cè)定HA的含量。常規(guī)方法下對(duì)免疫組化檢測(cè)組織實(shí)施脫蠟以及脫水處理，選擇馬血清對(duì)非特異性抗原進(jìn)行封閉處理，通過(guò)枸橡酸鹽緩沖液0.1 mol/L實(shí)施微波處理，選取H2O230%將內(nèi)源性過(guò)氧化物酶除去，相應(yīng)將兔抗大鼠多克隆抗體TgF-β1（1:100）、MMP-13（1:100）及TIMP-1（1:100）滴入其中，置于4℃環(huán)境下過(guò)夜，陰性對(duì)照選擇PBS進(jìn)行一抗代替，通過(guò)即用型SP免疫組化試劑盒的方法，實(shí)施DAB顯色、脫水、透明，利用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片，相應(yīng)對(duì)組織中TIMP-1、MMP-13、TgF-β1的水平實(shí)施測(cè)定。陰性片沒(méi)有著色表現(xiàn)，陽(yáng)性片細(xì)胞胞質(zhì)中有棕黃色表現(xiàn)，通過(guò)半定量方法對(duì)免疫組化結(jié)果實(shí)施判斷，每張切片各個(gè)位置對(duì)高倍鏡視野5個(gè)進(jìn)行隨機(jī)觀察，對(duì)其顯色程度及相應(yīng)范圍進(jìn)行詳細(xì)記錄。顯色程度表示：弱＋、中＋＋、中強(qiáng)+++、強(qiáng)＋＋＋＋。

1.2.4 顯色范圍

如果在高倍視野中占比＜1/4為＋，占1/4～2/4為＋＋，占2/4～3/4為＋＋＋，＞3，4為＋＋＋＋。然后進(jìn)行顯色指數(shù)計(jì)算，計(jì)算方法=顯色程度×顯色范圍，其中＋，＋＋，＋＋＋，＋＋＋＋相應(yīng)記為1，2，3，4分。類(lèi)蛋白表達(dá)的顯色指數(shù)最終結(jié)果為均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過(guò)軟件SSPS 18.0，用方差分析比較兩組有關(guān)計(jì)量資料含量的差別。

2 結(jié) 果

黃芪褻術(shù)湯干預(yù)治療后肝纖維化大鼠血清ALT、AST活性明顯降低（P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)表1。HA的含量明顯降低（P＜0.05）。

表1 肝纖維化大鼠黃芪提取物治療后血清ALT、AST活性及HA含量的變化（±s）

表1 肝纖維化大鼠黃芪提取物治療后血清ALT、AST活性及HA含量的變化（±s）

組別 動(dòng)物數(shù) AST（卡門(mén)氏單位） ALT（卡門(mén)氏單位） HA（μg/L）NS對(duì)照組 20 727.00±64.08 617.25±104.59 328.21±70.68黃芪褻術(shù)湯 20 79.40±19.05 167.40±32.21 241.88±77.77 t 30.21 19.35 23.87 P＜0.01 ＜0.05 ＜0.05

3 討 論

模型組與陽(yáng)性對(duì)照組比值僅為正常的1/2倍，通過(guò)黃芪褻術(shù)湯有效劑量實(shí)施干預(yù)之后，實(shí)施免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：模型組TIMP-1在間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)（中央靜脈周?chē)⒗w維間隔、肝竇部位）中能夠發(fā)現(xiàn)大量棕黃色著色，以上位置MMP-13也出現(xiàn)少量表達(dá)，選擇黃芪褻術(shù)湯有效劑量后，TIMP-1的表達(dá)得到顯著緩解，但是MMP-13的表達(dá)出現(xiàn)明顯上升，所以經(jīng)降低基因和蛋白水平，能夠使TIMP-L的表達(dá)降低、MMP-13表達(dá)提高，加快ECM過(guò)多的降解，緩解肝纖維化的嚴(yán)重性[1-3]。本實(shí)驗(yàn)中，黃芪褻術(shù)湯可明顯降低大鼠肝纖維化血清ALT和AST活性，降低HA含量。有效劑量組相較較模型組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肝組織TgF-β1基因和蛋白表達(dá)都更低。因?yàn)辄S芪褻術(shù)湯有效成分對(duì)HSC的激活形成了抑制，減少了TgF-β1釋放，從而減少了致纖維化因子釋放，所以減輕了肝纖維化的程度.不過(guò)黃芪褻術(shù)湯中有效成分有多種，具體哪一種成分能夠?qū)SC的激活形成抑制，還需往后更為深入的研究。

[1]陸石俊,劉輝華,謝 武,等.中藥聯(lián)合臭氧自血療法治療乙肝肝纖維化臨床觀察[J].中國(guó)急救醫(yī)學(xué),2015,35(z2):282-283.

[2]李春輝,潘理會(huì).中藥強(qiáng)肝溶纖湯-2對(duì)肝纖維化治療作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2013,29(18):2979-2982.