王雪偉， 任劍波， 王小怡， 王 博， 高 哲， 郭大瑋

(山西醫(yī)科大學法醫(yī)學院， 轉化醫(yī)學研究中心， 山西 太原 030001)

近來文獻發(fā)現(xiàn)，人類1號染色體開放閱讀框109 (human chromosome 1 open reading frame 109，c1orf109)基因(BmOrfGenBank ID：NM_017850.1)在多種腫瘤細胞系中表達上調(diào)，在乳腺癌Hs578T細胞中，c1orf109的外源性表達可誘導乳腺癌Hs578T細胞的增殖。c1orf109啟動子區(qū)、CAAT盒和TATA盒是其基礎調(diào)節(jié)的順式作用元件，GC盒在此基礎上抑制c1orf109的轉錄。而染色質(zhì)免疫沉淀技術(chromatin immunoprecipitation，ChIP)和凝膠電泳遷移實驗(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)均證明GC盒有結合轉錄因子特化蛋白1(specificity protein 1，Sp1)的位點[1]。許多研究發(fā)現(xiàn)，Myc相關鋅指蛋白(Myc-associated zinc-finger protein，MAZ)表達水平異?？梢源龠M許多腫瘤生長及炎癥進展過程[2-6]。亦有文獻報道MAZ和Sp1常共同參與同一個基因的表達調(diào)控，結合位點序列類似，并有重疊或共享結合位點的情況[7-10]，但也有文獻表明在某些基因的啟動區(qū)， Sp1和MAZ只結合各自的結合位點[11]。Sp1和MAZ有時共同激活基因的表達[8,12-13]，有時共同抑制基因的表達，如MAZ基因[7]；而對內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)基因的表達，Sp1與MAZ的作用相反，前者增強其表達，后者則抑制其表達[9]。關于c1orf109基因，目前尚未見到MAZ及Sp1對其轉錄調(diào)控的報道。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

THP-1細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；HeLa細胞及熒光報告系統(tǒng)的綠色熒光序列由山西醫(yī)科大學轉化醫(yī)學研究中心崔永萍教授惠贈；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco；胎牛血清購自天津康源生物技術有限公司；青、鏈霉素混合液(100×)購自北京索萊寶科技有限公司；末端脫氧核糖核酸轉移酶和化學發(fā)光法EMSA試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；EMSA所用探針的寡核苷酸均由Thermo Scientific合成；Biotin-11-dUTP購自Thermo Fisher；LipofectamineTM3000 Reagent購自Invitrogen；Sp1表達質(zhì)粒pN3-Sp1FL購自Addgene；pReceiver-MAZ表達質(zhì)粒購自Fulengen。

2 主要方法

2.1細胞培養(yǎng) 對凍存的THP-1和HeLa細胞進行復蘇，THP-1細胞以含10%胎牛血清與1%青、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液、HeLa細胞以含10%胎牛血清與1%青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng)。

2.2細胞核蛋白提取 復蘇的細胞穩(wěn)定傳2～3代后， 分別取指數(shù)增長期的THP-1和HeLa細胞按實驗目的用終濃度為10 mg/L的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激不同的時間。然后采用細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒分別提取THP-1細胞和HeLa細胞的核蛋白，保存于-80 ℃。BCA法進行核蛋白定量并利用酶標儀進行檢測。

2.3結合探針設計 據(jù)報道， MAZ和Sp1結合序列分別為5’- GGGCGG -3’和5’- GGGAGGG -3’[7]。利用PROMO 3.0.2對c1orf109基因轉錄起始點上游-2 500 bp～-1 bp的DNA序列進行轉錄因子結合位點預測，篩選出其中1段序列c1orf109WT -1 689～-1 670 bp(5’-TTCCCCGCCCTCCCCACCAA-3’)， 合成探針109進行EMSA實驗。為了分析Sp1與MAZ結合點的關系， 合成突變探針109M:c1orf109WT -1 692～-1 670 bp mutSp1 (5’-TGTTAAAAGCCCTCCCCACCAA-3’)和109S : c1orf109WT -1 692～-1 670 bp mutMAZ(5’-TGTTCCCCGCCCAAAACACCAA-3’)，分別將Sp1結合點和MAZ結合點突變。以Her等[11]報道的mut48探針(5’-GTCTTTGCGGGGGGGAGGGGA-3’)和mut38 探針(5’-GTCTGGGCGGGGTTTAGGGGA-3’)分別作為MAZ和Sp1的陽性對照探針。同時， 為競爭反應合成無關探針20(已做EMSA實驗無DNA-蛋白結合帶)為5’-TCCCAGCAACTGGAGCAGCTTCAT-3’。

2.4EMSA實驗 TE緩沖液(pH 8.0)溶解寡核苷酸單鏈后，按末端脫氧核糖核酸轉移酶說明書配制探針標記體系，以獲得生物素標記的單鏈寡核苷酸。將互補的寡核苷酸單鏈和PCR Buffer(10×)以9∶9∶2比例混勻，總體積20 μL，95 ℃孵育10 min，室溫2 h退火，獲得生物素標記的雙鏈探針， -20 ℃保存?zhèn)溆?。然后配制探針蛋白結合體系， 室溫結合20 min，恒壓、I=11～17 mA、TBE緩沖液(0.5×)條件下采用5.5%SDS-PAG進行電泳60 min；然后恒流、U=5～11 V條件下半干轉膜60 min，轉印至帶正電荷尼龍膜上，封閉、洗滌、底物反應、暗室曝光。其中Super-shift實驗中，探針、核蛋白及MAZ抗體需4 ℃孵育過夜。

2.5質(zhì)粒構建 利用實驗室前期構建的c1orf109啟動子區(qū)驅(qū)動的增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)報告載體，此報告載體(記作109)中EGFP的表達代表c1orf109蛋白的表達情況，且為了分析MAZ和Sp1在c1orf109基因啟動子區(qū)的活動，本實驗利用c1orf109報告載體中相關的限制性內(nèi)切酶去掉不同c1orf109啟動子區(qū)的一些片段，構建含有不同長度c1orf109啟動子區(qū)分析質(zhì)粒表達載體，切去-1 795～-1 506 bp的質(zhì)粒記作109A，切去-1 795～-918 bp的質(zhì)粒記作109B，切去-918～23 bp的質(zhì)粒記作109C，其啟動子區(qū)見圖1。

2.6細胞轉染后激光共聚焦顯微鏡及流式細胞術分析 取穩(wěn)定生長的HeLa細胞，以2～8×105密度用無雙抗培養(yǎng)基接種于6孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)12 h后轉染，轉染24 h后用激光共聚焦顯微鏡采集圖像，流式細胞術分析。 其中分析MAZ及Sp1對c1orf109的作用時，用c1orf109啟動子區(qū)驅(qū)動的EGFP報告載體與 MAZ表達質(zhì)粒和Sp1表達質(zhì)粒共轉染，即MAZ和Sp1過表達。陰性對照用共轉染同等量的pGL3空表達載體來控制。

Figure 1. The schematic diagram ofc1orf109 promoter region.

圖1c1orf109啟動子區(qū)結構示意圖

3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)來表示。應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差(one-way ANOVA)分析，以LSD或Dunnett’s T3法進行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 轉錄因子MAZ可與c1orf109啟動子區(qū)結合，且兩者有共享結合位點的情況

Her等[11]報道過，大鼠的PNMT基因啟動子區(qū)有結合點mut48和mut38，僅分別與MAZ和Sp1結合。EMSA結果顯示，c1orf109WT的-1 689 bp～-1 670 bp片段可以結合來自于THP-1細胞核蛋白的轉錄因子MAZ和Sp1，見圖2。

EMSA冷競爭結果顯示，分別用無關未標探針20，109M探針用量的1 200倍、未標陽性對照探針mut48，109M探針用量的300倍、100倍、70倍、40倍來競爭已標記的c1orf109M探針結合蛋白，無關未標探針未表現(xiàn)出競爭作用，而隨未標陽性對照探針mut48競爭倍數(shù)遞減，其競爭探針109M結合MAZ的作用逐漸減弱；EMSA冷競爭結果顯示，未標陽性對照探針mut38，109S探針用量的1 200倍，對已標探針109M結合THP-1核蛋白有明顯的競爭作用，突變掉Sp1結合點的探針109M也可結合Sp1，見圖2。

Figure 2. The probe 109, mutation probe 109M and 109S combined with MAZ and Sp1 from the nuclear proteins of cells were analyzed by EMSA.

圖2探針109及其突變探針109M和109S與細胞核提取物中的MAZ、Sp1結合的EMSA實驗結果

Super-shift結果顯示，探針109M，加HeLa細胞核蛋白及MAZ抗體后均有明顯的超遷移條帶；探針109S，加HeLa細胞核蛋白及MAZ抗體后也有明顯的超遷移條帶；c1orf109啟動子區(qū)可結合轉錄因子MAZ，且在c1orf109WT -1 689 bp～-1 670 bp上MAZ和Sp1兩者共享結合位點，見圖2。

2 轉錄因子MAZ和Sp1抑制c1orf109基因的轉錄表達

為了分析MAZ和Sp1在c1orf109基因啟動子區(qū)的活動，本實驗用含不同長度的c1orf109啟動子區(qū)的c1orf109報道載體和0.5 μg的MAZ或Sp1表達質(zhì)粒共轉染HeLa細胞，24 h后采用激光共聚焦顯微鏡觀察和流式細胞術分析，其中流式細胞術分析以EGFP的平均熒光強度值來評估c1orf109基因的轉錄表達情況。激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，過表達轉錄因子MAZ和Sp1后， EGFP表達減少，且過表達Sp1組的表達量減少更明顯。轉錄因子MAZ和Sp1抑制c1orf109基因的轉錄表達，且Sp1的抑制作用明顯大于MAZ；去MAZ和Sp1的結合點后，過表達MAZ和Sp1后EGFP表達量也相應減少，見圖3。

Figure 3. The confocal scanning microscopic observation results of transcription factor MAZ and Sp1 repressing the expression ofc1orf109invitro(×400).

圖3在體外實驗中轉錄因子MAZ和Sp1抑制c1orf109基因表達的激光共聚焦顯微成像觀察結果

對于c1orf109的所有表達載體，流式細胞術分析結果所示，過表達轉錄因子MAZ和Sp1后EGFP光蛋白表達減少，且過表達Sp1組的表達量減少更明顯。轉錄因子MAZ和Sp1抑制c1orf109基因的轉錄表達，且明顯Sp1的抑制作用大于MAZ；去MAZ和Sp1的結合點后，過表達MAZ和Sp1后，EGFP表達量也相應減少，與激光共聚焦顯微鏡分析結果相一致。MAZ和Sp1的抑制作用不僅僅只依靠與c1orf109啟動子區(qū)的直接結合，見圖4。

Figure 4. The results of flow cytometry analysis that transcription factor MAZ and Sp1 repressed the expression ofc1orf109invitro. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vspN3-Sp1 group;#P<0.05vsempty expression vector group.

圖4流式細胞術分析體外實驗中轉錄因子MAZ和Sp1抑制c1orf109轉錄表達的結果

討 論

1 轉錄因子MAZ與c1orf109啟動子區(qū)結合

Liu等[1]報道，c1orf109啟動子區(qū)，CAAT盒和TATA盒是基礎調(diào)節(jié)的順式作用元件，GC盒在此基礎上抑制c1orf109的轉錄，并證明GC盒有結合Sp1的位點。但目前并未有人報道轉錄因子MAZ可以與c1orf109啟動子區(qū)結合。MAZ是一種作用較廣泛的轉錄因子，研究發(fā)現(xiàn)MAZ表達水平異常可以促進許多腫瘤生長及炎癥進展過程，是癌癥發(fā)生發(fā)展過程中十分重要的影響因子之一[2-6]，而c1orf109基因在多種腫瘤細胞系中表達上調(diào)，如在乳腺癌Hs578T細胞中，c1orf109的外源性表達誘導乳腺癌Hs578T細胞的增殖[1, 14]；且據(jù)報道 Spl和MAZ常參與同一個基因的表達調(diào)控[8-14]。綜上所述， 本文通過PROMO軟件預測c1orf109基因轉錄起始點上游-2 500 bp～-1 bp的DNA序列與MAZ的結合位點，合成相關結合探針與HeLa細胞核提取物孵育并經(jīng)EMSA分析顯示轉錄因子MAZ可與c1orf109啟動子區(qū)結合。

2 轉錄因子MAZ和Sp1結合位點的關系

MAZ和Sp1的結合序列分別為5’-GGGCGG-3’ 和 5’-GGGAGGG-3’，序列非常相似，已有報道在MAZ基因[7]、HTlAr基因[8]、eNOS基因[9]、PNMT基因[10]和PTHr基因[12-13]上，MAZ與Sp1的結合位點有重疊，甚至兩者的結合點共享；但亦有報道在大鼠的PNMT基因[11]上MAZ和Sp1與它們各自的結合位點的結合是相互獨立的。為了進一步分析在c1orf109基因的啟動子區(qū)兩者的結合關系，本文分別用突變此結合位點MAZ點和Sp1點的相關生物素標記探針109S、109M與未標相關的陽性對照探針競爭結合THP-1細胞核蛋白， EMSA分析結果顯示，突變Sp1結合位點的探針109M也既可以結合MAZ也可結合Sp1。Super-shift結果示，探針109S也可結合MAZ。提示在c1orf109啟動子區(qū)轉錄因子MAZ和Sp1兩者有共享結合位點的情況。

3 MAZ與Sp1對c1orf109的復雜調(diào)節(jié)機制

據(jù)報道，MAZ和Sp1介導的對MAZ基因的抑制作用是相互獨立的，組蛋白的去乙?；竻⑴cMAZ的抑制作用，但在Sp1的抑制作用中卻招募DNA甲基轉移酶1。因此推測看家基因的下調(diào)可能由結合MAZ和Sp1后招募不同的抑制子來完成[15]。本實驗用限制性內(nèi)切酶去不同的c1orf109啟動子區(qū)的一些片段構建含有不同長度啟動子區(qū)c1orf109分析質(zhì)粒表達載體的109A、109B、109C來進一步分析Sp1和MAZ在c1orf109啟動子區(qū)的活動。經(jīng)體外轉染實驗、激光共聚焦顯微鏡觀察和流式細胞術分析結果顯示，截掉了MAZ和Sp1的結合位點后，過表達MAZ和Sp1對c1orf109的表達仍有抑制作用。綜上提示MAZ和Sp1不僅只通過直接結合c1orf109啟動子區(qū)來實現(xiàn)對c1orf109基因的調(diào)控，可能還招募其它的轉錄因子來參與對c1orf109的抑制, 由轉錄因子Sp1 和MAZ介導的分子網(wǎng)絡調(diào)節(jié)機制對c1orf109轉錄表達的抑制調(diào)控很重要，并且這種分子網(wǎng)絡調(diào)節(jié)機制可能很復雜；轉錄因子MAZ和Sp1的復雜調(diào)節(jié)在遺傳學上有重要意義，進而影響生物的生理進程。

4 轉錄因子MAZ和Sp1的調(diào)節(jié)作用對c1orf109的表達有重要意義

根據(jù)文獻報道， 轉錄因子MAZ和Sp1對基因表達調(diào)節(jié)的作用不盡相同。本文用構建的由c1orf109啟動子區(qū)驅(qū)動的綠色熒光報告質(zhì)粒與MAZ或Sp1表達質(zhì)粒共轉染HeLa細胞24 h后，激光共聚焦顯微鏡觀察及流式細胞術分析結果顯示，MAZ和Sp1均對c1orf109基因的轉錄表達有明顯的抑制作用，并且Sp1的抑制作用更強。根據(jù)報道，2種及以上的轉錄因子對基因的同一方向的調(diào)節(jié)這種功能性冗余概念已多次被提出，這種冗余調(diào)節(jié)對于相關基因的表達很重要，且細胞因子和轉錄因子的功能冗余性和遺傳冗余性是生物進化、生物復雜性和多樣性的基礎，有重要的理論意義和實際意義，應該深入研究[16]。如轉錄因子E2F家族表現(xiàn)有功能冗余性調(diào)節(jié)，在正常和腫瘤細胞中與染色質(zhì)結合的E2F家族可能是活性轉錄復合體的路標[17]。Snail家族是經(jīng)典的轉錄抑制子，在淋巴細胞的發(fā)育中轉錄因子Snail家族扮演重要角色，SNAI2和SNAI3的消除對影響成熟T細胞和B細胞的產(chǎn)生有重要作用[18]。在早期發(fā)展和細胞的生長和分化中，MAZ和Sp1及SP其它家族成員存在功能性冗余，且由Sp1家庭的轉錄因子(Sp1和Sp3)和MAZ介導的染色質(zhì)修飾和染色質(zhì)重塑的分子網(wǎng)絡機制，是未來了解富含GC啟動子的基因表達的關鍵[19]。而在c1orf109基因的轉錄表達調(diào)控中，MAZ和Sp1共同抑制其表達的這種冗余機制提示MAZ和Sp1對c1orf109的抑制調(diào)控對c1orf109基因表達有重要意義。c1orf109基因表達對機體的相關生命活動可能也有重要意義。據(jù)報道，c1orf109基因本身在多種腫瘤中表達上調(diào)，如在乳腺癌Hs578T細胞中，c1orf109的外源性表達誘導乳腺癌Hs578T細胞的增殖；且c1orf109基因還是CK2激酶的底物之一[1]，新的證據(jù)表明，被檢測的所有癌癥中CK2激酶表達上調(diào)[20-21]；因此，c1orf109基因與癌癥有著不可忽略的聯(lián)系，提示轉錄因子MAZ和Sp1對c1orf109的重要調(diào)節(jié)作用，可能對與c1orf109表達異常相關癌癥的病理生理過程有重要意義。

總之，本實驗首次報道c1orf109啟動子區(qū)可以結合轉錄因子MAZ，并且發(fā)現(xiàn)MAZ和Sp1有共享結合位點的現(xiàn)象；轉錄因子MAZ及Sp1共同抑制c1orf109的轉錄表達，且Sp1的抑制作用強于MAZ；MAZ和Sp1不僅只通過結合c1orf109啟動子區(qū)來實現(xiàn)對c1orf109基因的調(diào)控，可能還招募其它的轉錄因子來參與對c1orf109的抑制；綜上所述轉錄因子MAZ和Sp1的復雜調(diào)節(jié)及作用方向一致的冗余調(diào)節(jié)在遺傳學上有重要意義，進而影響生物的生理進程。

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