李冠軍， 亞國偉， 唐正嚴， 蘇開德

(南陽醫(yī)學高等專科學校第一附屬醫(yī)院 1泌尿外科， 2腫瘤科， 河南 南陽 473000； 3中南大學湘雅醫(yī)院泌尿外科, 湖南 長沙 410008； 4常德市第一人民醫(yī)院泌尿外科， 湖南 常德 415003)

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類由 19～25個核苷酸組成的非編碼單鏈小RNA，它可以通過與目標基因mRNA的非翻譯區(qū)結(jié)合，起到調(diào)控細胞生長、器官分化和腫瘤細胞的增殖侵襲等生物學行為的作用[1-3]。miR-153是一種重要的miRNA，在肺癌、乳腺癌和膀胱癌等惡性腫瘤中都有相應的異常表達[4-6]，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密不可分的關聯(lián)。

正性調(diào)控域鋅指蛋白(positive regulatory domain zinc finger protein，PRDM)是鋅指蛋白家族中的重要成員，具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性和抑制性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，在腫瘤細胞的增殖侵襲和器官分化等過程中起到重要作用，在腫瘤抑制蛋白家族中占有重要的一席之地[7-8]。

Janus激酶(Janus kinase，JAK)/信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT)信號通路近年在腫瘤侵襲方向的研究備受關注[9]。干擾素家族、gp130家族、單鏈蛋白家族和部分G蛋白偶聯(lián)受體的信號轉(zhuǎn)導途徑都與JAK/STAT信號通路有一定的關聯(lián)，通過該信號通路發(fā)揮作用[10-11]。

本研究旨在揭示miR-153和PRDM2在膀胱癌中的表達及對膀胱癌細胞侵襲和遷移能力的影響，并初步探討其可能的作用機制。

材 料 和 方 法

1 臨床標本采集及處理

收集2015年1月～2016年1月在我院手術切除并且經(jīng)病理檢查確診為膀胱癌組織50例，同時取配對正常膀胱組織50例。膀胱癌患者術前未進行放療。腫瘤組織離體后，去除血跡，放入4%多聚甲醛固定。

2 細胞系和主要試劑

人膀胱癌細胞系 J82、UM-UC-3、RT4和5637 購于中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，細胞均呈貼壁生長狀態(tài)，所用培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基?？筆RDM2、p-JAK2和p-STAT3的 I 抗均購自 Abcam；miR-153-mimic購自上海吉凱制藥技術有限公司；Transwell小室購自Millipore；PCR試劑盒均購自廣州復能基因有限公司。

3 方法

3.1免疫組織化學染色 將石蠟包埋好的組織行 4 μm 連續(xù)切片，60 ℃烤箱中烘烤 3～4 h；二甲苯溶液脫蠟 3 次，每次 15 min，梯度乙醇逐步水化，每次3 min；PBS 洗3次，每次3 min；將切片置入檸檬酸鹽緩沖液高壓修復10 min，再置于 PBS 液中浸洗3次，每次3 min；3%過氧化氫甲醇溶液封閉10 min，PBS 液洗3次，每次3 min；加山羊血清后靜置15 min后滴加 I 抗，4 ℃孵育過夜；37 ℃下復溫30 min，PBS+1‰ Tween 20 液浸洗3次，每次3 min；室溫下滴加 II 抗孵育15 min，PBS+1‰ Tween 20 液浸洗3次，每次3 min；滴加二氨基聯(lián)苯胺后觀察染色情況；蘇木素染色，清水沖洗3次，烘箱內(nèi)烘干，用中性樹膠進行封片。

3.2Western blot實驗 每孔加入30 μg PRDM2蛋白樣品，行10%SDS-PAGE。使用濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，1∶2 000 TBST稀釋 I 抗(羊抗人PRDM2、p-JAK2和p-STAT3單克隆抗體)，4 ℃過夜；加入辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG(1∶5 000)稀釋，室溫孵育2 h；ECL發(fā)光檢測。

3.3qPCR定量檢測miR-153和PRDM2的表達 首先合成雙向PCR引物，將反應混合液加熱至94～98 ℃保持20～30 s，反應溫度降至50～65 ℃時，引物與互補的序列形成氫鍵。miR-153上游引物序列為5’-GGGATGGAGTCGAGGTGCGGCTAAT-3’，下游引物序列為5’-GTAGGCTGAGGAAAGTCGAGCGAGC-3’；PRDM2上游引物序列為5’-AAATGCCGAATGGCGAGCGAGATTA-3’，下游引物序列為5’-TTGAGGGCGTGGGCAGGGAGAAATGC-3’。退火溫度72 ℃，維持20～40 s，繼續(xù)降低至68 ℃，PCR反應進行30～35個循環(huán)，68～74 ℃延伸5～10 min。根據(jù)熒光定量試劑盒操作說明配制反應體系，每組反應體系的體積為25 μL， 設置3個復孔， 每組樣本cDNA 均需行目的RNA和內(nèi)參照 GAPDH 熒光定量PCR擴增，DNA全部反應完畢，計算mRNA表達情況。

3.4雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?為進一步確證miR-153能夠靶向作用于PRDM2，本實驗將PRDM2的3’UTR區(qū)構建突變型螢光素酶報告基因載體。將螢光素酶報告載體與miR-153-mimic共轉(zhuǎn)染RT4細胞36 h后，收獲細胞。按螢光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測RT4細胞螢光素酶活性。相對螢光素酶活性=螢火蟲螢光素酶活性值/海腎螢光素酶活性值。

3.5Transwell侵襲實驗檢測膀胱癌細胞的侵襲能力 本實驗所用Transwell小室購自BD，小室孔徑為8 μm，底面厚度為8 μm。使用50 μL細胞培養(yǎng)基平鋪在小室底，Matrigel平鋪在小室上，常溫下凝膠后接種細胞。將RT4細胞濃度稀釋為 1×109/L，在小室上層加入300 μL含胎牛血清的細胞培養(yǎng)基，向每個小室上層加入25 μL的細胞懸液，然后置于37 ℃孵箱孵育24 h。用無菌棉簽輕度擦拭上室上層的細胞，擦拭干凈后用結(jié)晶紫染色10 min，倒去染液，PBS清洗5 min，然后于鏡下觀察并拍照計數(shù)。實驗重復3次。

3.6劃痕實驗檢測膀胱癌細胞的遷移能力 取對數(shù)生長期細胞接種到6孔板中，在恒溫孵箱中培養(yǎng)，等細胞長滿視野時進行后續(xù)實驗。使用黑色馬克筆于6孔板背后劃線。使用高溫滅菌的20 μL槍頭在孔板上垂直于線劃痕，保證槍頭劃痕時垂直。劃好后充分沖洗，將殘余懸浮細胞沖洗掉。然后向孔內(nèi)加入不含胎牛血清的細胞培養(yǎng)基，置于恒溫孵箱孵育。分別于24、48和72 h后在顯微鏡下取點，觀察，拍照。與0 h的初始距離作對比，分別測量細胞遷移的距離，計算細胞的遷移率。遷移率(%)=(D24/48/72 h-D0 h)/D0 h×100%。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，膀胱癌組織和正常膀胱組織中的PRDM2陽性表達率采用2檢驗比較，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 膀胱癌中miR-153和PRDM2的差異性表達

免疫組化結(jié)果顯示，PRDM2定位在細胞膜和細胞漿，在膀胱癌組織中表達水平較高，見圖1A；miR-153在膀胱癌組織中表達明顯低于正常膀胱組織(P<0.05),見圖1B。50例膀胱癌組織中，43例PRDM2表達陽性；50例正常膀胱組織中，8例PRDM2表達陽性，膀胱癌組織中PRDM2的陽性表達率相對于正常膀胱組織明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

Figure 1. The expression of PRDM2 (A) and miR-153 (B) in bladder cancer detected by immunohistochemical staining (×20) and qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal bladder tissue group.

圖1PRDM2和miR-153在膀胱癌組織和正常膀胱組織的表達情況

表1膀胱癌與正常膀胱組織中PRDM2的表達比較

Table 1. The expression of PRDM2 in bladder cancer tissues and normal bladder tissues (n=50)

GroupPRDM2proteinexpressionPositiveNegativeNormalbladder842Bladdercancer43* 7*

*P<0.05vsnormal bladder.

2 PRDM在不同膀胱癌細胞株中的表達

Western blot 實驗結(jié)果顯示，與J82、UM-UC-3和5637細胞株相比，PRDM2蛋白在RT4細胞株中表達最低(P<0.05)，見圖2，所以后續(xù)實驗我們選取膀胱癌細胞RT4作為實驗細胞株。

3 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-153與PRDM2的靶向關系

生物信息學軟件(TargetScan)預測，miR-153可以調(diào)控PRDM2的表達。qPCR結(jié)果表明，和對照組比較，膀胱癌RT4細胞轉(zhuǎn)染miR-153-mimic后，PRDM2的mRNA水平明顯降低(P<0.05)。為了進一步證實PRDM2是miR-153下游的靶向基因，我們使用雙螢光素酶報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)，過表達miR-153后，RT4細胞PRDM2的轉(zhuǎn)錄活性相應下調(diào)(P<0.05)，而將PRDM2的3’-UTR突變后，miR-153的抑制作用消失，見圖3。

Figure 2. The expression of PRDM2 in different bladder cancer cell lines. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsRT4.

圖2PRDM2在不同膀胱癌細胞株中的表達

Figure 3. The expression of PRDM2 was regulated by miR-153. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖3miR-153調(diào)控PRDM2的表達

4 Transwell實驗檢測過表達miR-153后膀胱癌細胞侵襲能力的變化

Transwell實驗結(jié)果顯示，miR-153-mimic組穿透基質(zhì)膠的細胞數(shù)量明顯少于NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。該結(jié)果表明，過表達miR-153后可以有效抑制膀胱癌RT4細胞的侵襲能力。

Figure 4. The effect of miR-153 over-expression on the invasion ability of RT4 cells detected by Transwell invasion assay (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖4Transwell侵襲實驗檢測過表達miR-153對膀胱癌細胞RT4侵襲能力的影響

5 劃痕實驗檢測過表達miR-153后膀胱癌細胞的遷移能力的變化

劃痕實驗結(jié)果表明，與NC組相比，在24、48和72 h時，miR-153-mimic組遷移率均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。該結(jié)果表明，過表達miR-34a可以抑制RT4細胞的遷移能力。

Figure 5. The effect of miR-153 over-expression on the migration ability of RT4 cells detected by wound healing assay (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖5劃痕實驗檢測過表達miR-153對膀胱癌細胞RT4遷移能力的影響

6 過表達miR-153后JAK/STAT信號通路蛋白水平的變化

Western blot實驗結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-153-mimic組中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平明顯降低(P<0.05)，見圖6。這說明miR-153的過表達可以有效下調(diào)p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平。

Figure 6. Over-expression of miR-153 down-regulated the protein levels of p-JAK2 and p-STAT3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖6過表達miR-153后p-JAK2和p-STAT3蛋白水平降低

討 論

最近很多研究都報道m(xù)iRNA在人類腫瘤中扮演很重要的角色。一般來說，miRNA作為一種腫瘤抑制因子，通過下調(diào)促癌基因的表達或者上調(diào)抑癌基因的表達來達到抑癌的作用。miRNA可以參與到生物機體的很多生物學進程中，比如細胞分化、增殖和侵襲等[12]。有學者研究表明，miRNA可以調(diào)控20%～30%的基因的表達，對機體蛋白的平衡表達提供至關重要的協(xié)調(diào)作用[13-14]。Yuan 等[15]指出，miR-153在肺癌中可以通過抑制AKT的表達起到抑癌作用；Ghasemi等[16]報道在膠質(zhì)瘤細胞中miR-153可以下調(diào)Bcl的表達誘導腫瘤細胞凋亡；Niu等[17]的研究表明miR-153T可以上調(diào)TGF-β2的表達影響骨肉瘤細胞株的生物學行為。 但是miR-153在膀胱癌中的表達及影響機制目前尚未有研究報道。

PRDM與腫瘤關系密切，由于PRDM基因啟動子甲基化、基因缺失和基因突變等原因?qū)е碌鞍妆磉_變化，某些抑癌基因失活，導致多種腫瘤發(fā)生。PRDM家族基因在大部分腫瘤中扮演抑癌基因的角色。PRDM2基因包括內(nèi)外2種啟動子，外部啟動子產(chǎn)物為缺失的短鏈PRDM2蛋白，通過基因甲基化影響后續(xù)轉(zhuǎn)錄過程起到抑制腫瘤的作用。通常來說，短鏈PRDM2蛋白是PRDM2的主要表達形式，一旦出現(xiàn)基因突變或失活的情況，PRDM2表達水平降低甚至出現(xiàn)表達缺失的情況，則不能有效抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[18]。Wu等[19]研究PRDM2基因與腫瘤的關系，檢測了膀胱癌細胞株的基因表達情況，其研究均未檢測RT4細胞。

STAT在多種惡性腫瘤組織及細胞系中廣泛存在，在正常組織中很少出現(xiàn)STAT及其家族蛋白的活化情況[20]。比如在多種鱗狀細胞癌、淋巴瘤、肺癌、腎細胞癌、前列腺癌、胰腺癌和宮頸癌中均有大量文獻報告存在STAT的活化現(xiàn)象。而JAK則是負責活化STAT的酪氨酸激酶[21-23]。STAT家族中的STAT3蛋白，廣泛存在于多種腫瘤組織中，影響腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲等一系列的生物學行為，扮演促癌基因的角色。作為STAT3上游的JAK因子，有報道指出，通過使用SG490(JAK體外阻斷劑)可以減緩急淋白血病的發(fā)病進程[24]。有研究提示，PRDM2和JAK/STAT信號通路在多酚類的抑癌作用中扮演關鍵的調(diào)控作用[25]?？傊?，JAK/STAT信號通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。

本實驗觀察在體外環(huán)境下miR-153靶向PRDM2在膀胱癌的作用。體外實驗表明，miR-153可以靶向PRDM2調(diào)控膀胱癌的生物學行為，而且miR-153可能通過PRDM2的表達而起到對PRDM2對膀胱癌的抑制作用。而后面繼續(xù)通過Western blot實驗檢測過表達miR-153后JAK/STAT信號通路蛋白水平的變化，顯示miR-153過表達后可能通過降低PRDM2的表達，下調(diào)p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平，進而影響膀胱癌細胞的侵襲和遷移。

本研究表明miR-153在膀胱癌組織中表達減低，而PRDM2在膀胱癌組織中表達明顯增高，同時發(fā)現(xiàn)miR-153可以靶向調(diào)控PRDM2的表達，通過JAK/STAT信號通路調(diào)控膀胱癌細胞的侵襲和遷移，提示miR-153和PRDM2可能參與膀胱癌的發(fā)展過程，有可能成為預測膀胱癌的發(fā)生和進展的標志物。

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