陳媛媛，趙彥萍，方繼良*，錢天翼，洪 洋，柳桂勇，張國雷，王 珺，王 寅，劉 勇，徐凱彬，李小嬌

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院放射科，3.針灸科，北京 100053；2.西門子醫(yī)療系統(tǒng)有限公司東北亞MR協(xié)調(diào)部，北京 100102；4.中國科學(xué)院自動化研究所腦網(wǎng)絡(luò)組研究中心，北京 100190)

MRI因其無輻射并可獲得高分辨率的解剖和功能圖像，已廣泛應(yīng)用于針灸腦機(jī)制的研究。針刺時腦內(nèi)可誘發(fā)明顯的正激活或負(fù)激活信號，負(fù)激活現(xiàn)象主要分布在邊緣葉—旁邊緣葉—新皮層網(wǎng)絡(luò)，其中前額葉內(nèi)側(cè)皮層(medial prefrontal cortex， MPFC)有顯著的負(fù)激活改變，此腦區(qū)與情志、疼痛調(diào)節(jié)等相關(guān)[1-4]。動物實驗[5]表明，這種負(fù)激活信號的改變與神經(jīng)的新陳代謝的抑制相關(guān)。但這種腦激活效應(yīng)是否存在相應(yīng)的神經(jīng)遞質(zhì)變化，還需深入研究。本研究聯(lián)合采用BOLD-fMRI及MRS技術(shù)，建立正負(fù)激活定量計算方法，獲得腦激活綜合值，并計算γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid, GABA)定量值，旨在驗證本研究建立的多模態(tài)技術(shù)方案的有效性和可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年9月—12月健康志愿者20名，男4名，女16名，年齡20～30歲，平均(24.5±1.4)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①右利手；②無fMRI禁忌證：③均為醫(yī)科大學(xué)在讀本科生及研究生，既往無明確腦外傷及腦疾病，無癲癇、抑郁、焦慮、失眠等神經(jīng)精神疾病病史。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核通過，受試者均簽署知情同意書。

1.2 儀器與方法 采用Siemens Magnetom Skyra 3.0T MR掃描儀，20通道頭線圈，一次性針灸針(規(guī)格0.4 mm×25 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。MR掃描順序依次為全腦三維高分辨率T1WI、BOLD靜息態(tài)fMRI、任務(wù)前MRS、BOLD任務(wù)態(tài)fMRI、任務(wù)態(tài)MRS。

全腦三維高分辨率T1WI采用MPRAGE序列，TR 15 ms，TE 6.9 ms，翻轉(zhuǎn)角15°，F(xiàn)OV 256 mm×256 mm，矢狀位掃描196層，層厚1 mm，無間隔。

采用同時多層EPI序列，TR 750 ms，TE 30 ms，翻轉(zhuǎn)角90°，矩陣70×70，F(xiàn)OV 210 mm×210 mm，層厚3 mm，無間隔層間距，共掃描48層，體素大小3 mm×3 mm×3 mm，共掃描 6 min 46 s。全腦軸位掃描平行于前后聯(lián)合連線，包括小腦和腦干，空掃30 s，以減少早期受試者不適應(yīng)而影響腦功能變化。囑受試者掃描時閉眼、不睡覺、不專注思維。BOLD任務(wù)態(tài)掃描參數(shù)同靜息態(tài)。對志愿者手針針刺。刺激方法：針刺受試者右側(cè)合谷穴，詢問有無針感或異常感覺。囑受試者閉眼靜息，針灸師戴耳機(jī)，聽取醫(yī)師口令，3次捻針，平補(bǔ)平瀉，頻率60次/分，每次持續(xù)30 s，為保證刺激后時間信號曲線返回到基線水平，根據(jù)既往試驗結(jié)果，2次捻針間隔為2 min，見圖1。

圖1 針刺Block設(shè)計方案

MRS掃描采用J差分點(diǎn)分辨波譜(J-different edited point resolution spectroscopy， MEGA-PRESS)序列，TR 2 000 ms，TE 68 ms，Averages 128，編輯脈沖頻率1.9 ppm，編輯中心頻率4.7 ppm，共掃描8 min 40 s。波譜掃描前勻場，全寬半高小于30。MRS定位框大小35 mm×30 mm×25 mm，位于雙側(cè)MPFC，垂直于前后聯(lián)合連線的平行線(長方體后壁的中點(diǎn)位于胼胝體尖端，圖2A)，掃描時設(shè)置飽和帶，位于定位框的前、上、下位置，以減少偽影及增加掃描成功率。任務(wù)態(tài)MRS掃描參數(shù)同任務(wù)前MRS，刺激的組塊設(shè)計與任務(wù)態(tài)BOLD掃描一致，針灸師再次對受試者進(jìn)行3次合谷穴刺激，方法同BOLD任務(wù)態(tài)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 MRS 將MRS原始數(shù)據(jù)先轉(zhuǎn)化為*.rda格式，采用LC Model軟件行后處理[6]，GABA波峰位于3.0 ppm處，獲得GABA濃度定量數(shù)據(jù)及曲線。

1.3.2 fMRI 將fMRI原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為*.nii格式，采用SPM 12軟件行預(yù)處理，包括頭動校正、標(biāo)準(zhǔn)化及平滑。采用一般線性模型建模，個體水平統(tǒng)計推斷P值為0.05。采用xjView軟件查看腦區(qū)正激活、負(fù)激活的位置及強(qiáng)度。

在Matlab平臺，采用SPM 12軟件分割高清三維T1WI圖像的灰質(zhì)、白質(zhì)和腦脊液。將所有受試者灰質(zhì)圖進(jìn)行變形，標(biāo)準(zhǔn)化到蒙特利爾空間，ROI體素大小定義為1.5 mm×1.5 mm×1.5 mm，計算獲得ROI的灰質(zhì)體積分?jǐn)?shù)。分別計算ROI灰質(zhì)的BOLD正、負(fù)激活的體素數(shù)量及平均峰值(超過閾值的平均值，閾值P=0.05，T=1.6479)，根據(jù)公式計算正激活和負(fù)激活所有體素的平均激活綜合值(Pm)，公式為：

Va表示正激活體素數(shù)量，Pa表示正激活平均峰值，Vd表示負(fù)激活體素數(shù)量，Pd表示負(fù)激活平均峰值。Pm為正值為正激活值，Pm為負(fù)值則為負(fù)激活值。

2 結(jié)果

20名受試者均完成了BOLD掃描，圖像頭動范圍小于1.5 mm，均符合后處理要求。排除MRS波譜曲線不穩(wěn)定的1名受試者，9名受試者曲線穩(wěn)定，納入研究。

2.1 BOLD信號定量結(jié)果 20名受試者中，9名受試者呈正激活，Pm平均定量值為1.17±0.16；11名受試

者呈負(fù)激活，Pm平均定量值為-1.31±0.17。見圖2B。

2.2 GABA定量結(jié)果 9名MRS結(jié)果合格的受試者中5名受試者Pm<0，呈負(fù)激活，其中4名受試者GABA濃度在針刺后下降，1名受試者GABA濃度在針刺后升高；4名受試者Pm>0，呈正激活，其中3名受試者GABA濃度在針刺后升高，1名受試者GABA濃度在針刺后降低。9名受試者針刺前GABA平均濃度為(19.93±1.04)nmol/L，針刺后平均濃度為(20.04±0.81)nmol/L，針刺前、后GABA差值平均為(0.11±1.60)nmol/L。見圖2C。

3 討論

3.1 研究基礎(chǔ) MRS是目前唯一可無創(chuàng)性定量分析活體內(nèi)某一特定組織區(qū)域化合物的檢查技術(shù)。GABA是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，由谷氨酸通過谷氨酸脫羧酶的作用合成[7]，在大腦中的含量較低，且與其他代謝物的共振峰重疊，因此需采用特殊的MEGA-PRESS序列采集[8]。該方法可區(qū)分濃度較低的GABA與谷氨酸或谷氨酰胺(Glx)，已成功應(yīng)用于評估腦區(qū)GABA的濃度，包括額葉、頂葉等[9-11]。另外，MRS已經(jīng)有較成熟的后處理軟件，其中LC Model方法及所處理的數(shù)據(jù)結(jié)果已被廣泛認(rèn)可[12]。

目前，BOLD-fMRI結(jié)合MRS的定量研究方法尚未廣泛開展。本研究將BOLD正、負(fù)激活信號在ROI內(nèi)進(jìn)行綜合定量。Northoff等[13]對12名健康受試者采用BOLD-fMRI結(jié)合MRS掃描，在情緒圖片刺激和靜息兩種狀態(tài)下，觀察右側(cè)前扣帶回(anterior cingulate cortex， ACC)中負(fù)激活與GABA濃度的關(guān)系，將ROI定位于右側(cè)MPFC，結(jié)果顯示ACC中GABA的濃度與相同區(qū)域的BOLD負(fù)激活具有相關(guān)性，提示情緒中樞的默認(rèn)模式網(wǎng)絡(luò)腦區(qū)ACC的BOLD負(fù)激活效應(yīng)可能由GABA介導(dǎo)。Duncan等[14]對13名健康受試者進(jìn)行fMRI與MRS結(jié)合的方法掃描，受試者接受同情任務(wù)、獎賞任務(wù)后行MR掃描，ROI定位于上前扣帶皮質(zhì)層(perigenual anterior cingulate cortex, pgACC;20 mm×10 mm×20 mm)、亞屬前扣帶皮層(subgenus anterior cingulate cortex, sgACC;20 mm×10 mm×20 mm)、左前島葉(對照，15 mm×10 mm×20 mm)，結(jié)果顯示任務(wù)引起pgACC的BOLD負(fù)激活效應(yīng)與任務(wù)誘發(fā)sgACC的BOLD正激活效應(yīng)相互作用，進(jìn)一步證實腦區(qū)間的連接與谷氨酸濃度，特別是pgACC中的谷氨酸濃度有關(guān)。

圖2 14號受試者，男，23歲 A.MRS定位圖，紅色為ROI； B.BOLD任務(wù)態(tài)針刺結(jié)果腦功能激活圖，紅色表示正激活，藍(lán)及綠色表示負(fù)激活，箭示MPFC和前扣帶回喙部，為主要負(fù)激活區(qū)域； C.MRS波譜圖，GABA波峰位于3.0 ppm處(箭)

本研究與既往研究[13-14]所分析的腦區(qū)相似，均圍繞ACC，探索ACC中BOLD任務(wù)態(tài)正、負(fù)激活與神經(jīng)遞質(zhì)(GABA/谷氨酸)濃度變化的相關(guān)性；但受試者接受任務(wù)不同，本研究采用任務(wù)為針刺右側(cè)合谷穴位捻針，探討針刺引起的負(fù)激活效應(yīng)的GABA基礎(chǔ)。

3.2 穴位及ROI的選擇 Hui等[2]研究手針針刺合谷穴、足三里穴、太沖穴的fMRI腦功能成像，結(jié)果顯示，明顯的負(fù)激活腦區(qū)主要位于雙側(cè)MPFC、前扣帶回、下丘腦、殼核、海馬、杏仁核、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等；3個穴位中，針刺合谷穴產(chǎn)生最廣泛、最強(qiáng)的負(fù)激活效應(yīng)，主要位于MPFC/ACC頭部。隨后，在手針捻針的研究[3-4]中也發(fā)現(xiàn)，邊緣葉—旁邊緣葉—新皮層網(wǎng)絡(luò)表現(xiàn)為明顯的負(fù)激活，其中MPFC/ACC頭部負(fù)激活最為明顯。提示MPFC/ACC是重要的情緒、疼痛等調(diào)控中樞，是針刺治療抑郁、焦慮、急慢性疼痛的關(guān)鍵腦區(qū)。因此本研究選擇合谷穴，ROI選擇雙側(cè)MPFC。

3.3 掃描序列順序 2007年Fusumada等[15]對18只Wistar大鼠雙側(cè)足三里穴進(jìn)行電針刺激，與7只非足三里穴大鼠對照，均采用電針儀刺激20 min，頻率為2 Hz，強(qiáng)度2 mA；結(jié)果顯示實驗組大鼠腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(periaqueduetal gray, PAG)背側(cè)GABA增加。唐毓環(huán)等[16]對17只大鼠雙側(cè)足三里穴電針刺激15 min，以疏密波電流刺激，強(qiáng)度2～3 V，舒波頻率16 Hz，密波頻率44 Hz；結(jié)果顯示電針刺激足三里穴引起痛閾明顯上升，電針組韁核GABA含量高于對照組，谷氨酸含量無差異，提示GABA含量在針刺15～20 min可發(fā)生變化。本研究中掃描BOLD任務(wù)態(tài)及任務(wù)態(tài)MRS時按Block設(shè)計，在合谷穴捻針刺激，兩個序列掃描時間共約15 min(6 min 46 s+8 min 40 s)，再加上兩個序列之間需要MRS重新定位、測試勻場約5 min，因此本研究設(shè)計的MRS掃描時間為針刺后20 min左右，可測得GABA值在針刺前后的變化。

3.4 MRS的優(yōu)化方案 本研究11名受試者的MRS波譜曲線不穩(wěn)定，后經(jīng)反復(fù)測試調(diào)整，9名受試者曲線穩(wěn)定，納入研究。筆者認(rèn)為MRS掃描對磁場均勻性要求較高，定位時應(yīng)盡量避開脂肪、血管、顱骨、腦室等結(jié)構(gòu)[17]。本研究初期掃描過程中發(fā)現(xiàn)金屬、假牙、染發(fā)、頭部外傷等對勻場產(chǎn)生明顯的不利影響，后在受試者錄入時，詢問相關(guān)情況，避免以上因素的干擾，節(jié)約勻場達(dá)到合格的時間，提高了MRS的精確性。

總之，本研究建立了多模態(tài)(BOLD-fMRI及MRS)的腦功能定量研究方法，成功率較高，檢測到針刺時ROI的多模態(tài)腦功能變化，并可計算獲得定量結(jié)果，在針刺腦效應(yīng)機(jī)制研究上具有可行性。

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