余佩沅 任輝 沈耿楊 張志達 余翔 黃錦菁 招文華 尚奇 梁德 楊志東 江曉兵*

1．廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 5104052．廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)在臨床疾病的廣泛應(yīng)用，據(jù)統(tǒng)計，1%的美國人長期使用GC進行治療，然而長期使用GC具有明顯的副作用，超過10%長期使用GC的患者被診斷為骨折，而且伴有明顯的骨量流失，導(dǎo)致激素性骨質(zhì)疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)的發(fā)病率逐年上升，在骨質(zhì)疏松癥中其發(fā)病率居于第三位，僅次于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松及老年性骨質(zhì)疏松[1]。GIOP是一種由GC所引起的以骨量減少，骨的微細結(jié)構(gòu)破壞，骨的脆性增加為特征，從而容易發(fā)生骨折的全身性骨病[2]。本文就GIOP的發(fā)病信號通路研究進行綜述，以尋求更好的靶向治療途徑。

1 GIOP經(jīng)典的發(fā)病信號通路

GC介導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥的形成途徑主要通過抑制骨形成信號通路調(diào)控蛋白或促進骨吸收信號通路調(diào)控蛋白的合成或釋放，最終造成骨量的流失。

GC 抑制 Wnt 信號通路，從而抑制骨形成。Wnt 信號通路與一些蛋白質(zhì)的相互作用密切相關(guān)，對各種細胞和組織的發(fā)育和功能具有重要作用[3,4]。越來越多的證據(jù)[5,6]表明：Wnt/β-catenin信號通路也是控制成骨細胞(osteoblast，OB)代謝方面的重要分子機制之一，是成骨形成的必要條件。然而研究證明，GC 通過上調(diào)Wnt 抑制因子 DKK-1 和 sclerostin 的表達，激活GSK-3β和使 β-catenin 失去穩(wěn)定性，衰減 Wnt 信號通路，下調(diào)OB Wnt 信號通路，從而抑制 Wnt/ β-catenin 經(jīng)典途徑。

RANKL由OB分泌，其結(jié)合并激活位于破骨細胞(osteoclast，OC)前體表面的受體RANK，誘導(dǎo)破骨的形成。OPG 則是 RANKL的天然抑制劑，能夠抑制 RANKL 與OC上受體RANK 結(jié)合[7,8]。研究表明，GC不僅能促進OC生成和抑制 OPG 產(chǎn)生，并且刺激OB譜系產(chǎn)生OPG受體，與 RANKL 競爭OPG，從而促進骨的吸收導(dǎo)致骨量減少，骨強度降低。另有研究[9-11]結(jié)果表明hRANKL 敲除老鼠，通過抑制RANKL系統(tǒng)能防止激素性骨量減少和強度下降。

BMPs是誘導(dǎo)非成骨細胞分化為成熟成軟骨細胞、OB的關(guān)鍵蛋白，對促進新生骨和軟骨形成有重要[12,13]。GC可以拮抗BMP-2促進OB分化成熟、誘導(dǎo)軟骨和新生骨形成的過程[14]。另有研究[15]發(fā)現(xiàn)GC可以通過影響B(tài)MP下游>50 kb的編碼序列而抑制BMP的轉(zhuǎn)錄，且對BMP-2和BMP-4的抑制作用更為明顯。

GC作用于骨代謝分子信號通路已經(jīng)有一定的研究，除了上述所報道的分子信號通路以外，對于GIOP經(jīng)典研究還包括PTH、Hippo、NF-κB、IGF-1通路等，在此不再作詳細描述。

2 GIOP通路機制的研究進展

近年來，自噬相關(guān)信號通路已被證實在OB分化或OC退變過程中起到重要作用，而非編碼RNA作為通路的調(diào)節(jié)因子和新型標志物，可作為GIOP發(fā)病機制研究另一新方向。

2.1 自噬

自噬是指一個吞噬或降解自身細胞質(zhì)蛋白或細胞器，以實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新的過程[16]。人體隨著年齡增長，體內(nèi)自噬水平不斷下降，這是年齡增長造成骨強度下降的一個原因[17]。mTOR在上游影響自噬誘導(dǎo)階段負性調(diào)控自噬水平，而自噬通過參與調(diào)節(jié)OC的活性而調(diào)節(jié)骨吸收，mTOR 通路的抑制會促進自噬，同時mTOR的抑制可以降低OC的活性，減少OC數(shù)量mTOR是負性調(diào)控自噬水平的主要信號通路，自噬通過參與調(diào)節(jié)OC的活性而調(diào)節(jié)骨吸收，同時通過抑制mTOR以調(diào)節(jié)OB分化促進骨形成。而LC3、Beclin1蛋白是典型的自噬體的標志物[18]。

高水平的GC對OC的自噬有促進作用，GC誘導(dǎo)后OC的LC3-I和LC3-II的表達增加，同時對負向調(diào)控自噬水平的AKT、p70S6K mRNA的表達有明顯抑制作用[19]。 研究GC對OB自噬水平的影響發(fā)現(xiàn)，低水平的GC對OB的自噬有一定促進作用，高水平的GC對OB的自噬是有抑制作用[20]。

通過上述可見GC對OB的自噬作用與濃度相關(guān)，生理劑量的GC作用于OB與OC，相互之間拮抗，保持骨量的平衡。如GC超過生理劑量，骨代謝則會失衡，OC自噬水平的增加，OB自噬減少是引起骨強度下降的一個重要原因。

也有研究[21]發(fā)現(xiàn)，GC能夠影響B(tài)MSCs的增殖分化，而BMSCs體內(nèi)自噬的作用有助于BMSCs增殖和防止凋亡，是應(yīng)對GC造成骨量流失的重要途徑。目前針對自噬與GIOP之間關(guān)系的研究已經(jīng)取得了一定的進展。其具體通路機制復(fù)雜，還未能完全闡明，但是研究顯示，自噬的作用影響了GIOP的發(fā)病、治療的各個階段，若加以研究，自噬途徑將在預(yù)防和治療GIOP領(lǐng)域發(fā)揮巨大作用。

2.2 非編碼RNA

非編碼RNA家族作為一種新型的通路調(diào)控因子，參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化及代謝等生理過程，也參與調(diào)節(jié)機體的各種病理過程，對骨代謝過程有著重要影響作用。

2.2.1miRNA

miRNA是長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于真核生物中，每個miRNA可以有多個靶基因，而若干個miRNA也可以調(diào)節(jié)同一個基因，通過這樣的復(fù)雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)而影響細胞增殖、分化及凋亡。Runx2 和其下游Osterix是miRNA的作用靶點，miRNA通過與其相互作用而調(diào)節(jié)骨代謝[22]。Runx2是促進OB分化和骨質(zhì)形成的重要因子，其可促進骨鈣素、堿性磷酸酶(ALP)等促成骨因子表達。Osterix(OSX)是繼Runx2后發(fā)現(xiàn)的促進OB分化的另一重要因子。且miRNA水平能反應(yīng)BMSCs 分化作用，部分miRNA在BMSCs向OB分化過程中表達減少[23]。

有研究[24]發(fā)現(xiàn)在GIOP動物模型中的miRNA表達發(fā)生了顯著變化，以 miR-672-5p的上調(diào)和miR-146 a-5p的下調(diào)最為明顯，這表明它們有可能參與骨代謝的調(diào)節(jié)。在體外實驗方面，miR-106b在體外能負向調(diào)控BMSCs的分化，抑制OB成熟分化，且在GIOP模型小鼠中表達增加[25]。GC可誘導(dǎo)OC分化且抑制了miR-338-3p的表達，增加骨吸收，且這可能與RANKL通路有所關(guān)聯(lián)[26]。而Liang等[27]發(fā)現(xiàn)，miR-124可以減少GC受體的表達，從而阻止了GC對骨形成的抑制作用。另外，GC也能下調(diào)miR34 a表達[28]，而miR34 a能通過靶基因?qū)谴x、干細胞增殖與分化、OB、OC的增殖與分化、細胞周期及細胞凋亡與自噬等均具有重要調(diào)控作[29]。這些基礎(chǔ)實驗研究表明，miRNA作為一種重要的通路調(diào)控因子，無論從成骨還是破骨通路，miRNA都能從中影響骨代謝，而且在GC的調(diào)控下，不少的miRNA都有不同的上調(diào)或下調(diào)，而通過對這些特異性 miRNA 的不斷發(fā)現(xiàn)和深入研究，為今后開展更多miRNA相關(guān)臨床實驗打下堅實的基礎(chǔ)。

而在臨床方面，已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在激素性股骨頭壞死的患者血漿中，miR-1207-5p和miR-887的表達明顯上調(diào)，明顯下調(diào)的是miR-96-5p和miR-576-5p，這說明miRNA在GC影響骨代謝當(dāng)中起了一定作用，那么在GIOP患者血清中這些miRNA是否也存在上調(diào)或下調(diào)呢？這也是值得我們以后思考和研究的。

miRNA的種類繁多，且調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，但miRNA特異性較高，可作為新的生物學(xué)標記，若加以研究，深入認識其生物學(xué)效應(yīng)，更好地幫助研究GIOP的發(fā)病機制，并可能提出新的診斷依據(jù)，為該病的靶向治療提供一個全新的技術(shù)平臺。由于現(xiàn)階段我們對miRNA 的認識和研究還十分有限，對于數(shù)目龐大未知的特異性miRNA，我們需要努力去探索；對于已知的特異性miRNA還要繼續(xù)深入研究，明確其功能、調(diào)控機制、作用靶點、作用劑量、活性因素、表達時序性及不同miRNA在同一生命過程中相互之間的聯(lián)系對靶向治療GIOP必有重大幫助。

2.2.2lncRNA

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是指長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，lncRNA不止在遺傳信息中承擔(dān)載體的角色，而且更多地承擔(dān)了對細胞周期、分化的調(diào)控功能，從而對骨代謝形成重要作用。

Tong等[30]發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松患者中的lncRNA-DANCR表達呈現(xiàn)高表達，同時DANCR對TNFα、IL-6等影響OC的炎癥因子的表達有促進作用。Li等[31]在骨質(zhì)疏松大鼠模型發(fā)現(xiàn)lncRNA-H19可以通過抑制Wnt信號通路，進一步促進Dkk-4的表達，從而抑制骨形成。

雖然lncRNA已被證實在動物模型的骨代謝過程中有一定的調(diào)控作用，但對lncRNA的研究仍處于起步階段，仍需大量的基礎(chǔ)及臨床相關(guān)實驗去證實lncRNA對骨代謝影響的作用，且目前對lncRNA與GIOP的靶向研究仍較缺乏，GC對lncRNA影響的需要進一步研究。

3 通路間的交聯(lián)反應(yīng)(crosstalk)

各信號通路和調(diào)節(jié)因子已被證實對GIOP的形成有著重要作用，而隨著信號通路研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)各通路或調(diào)節(jié)因子之間有相互聯(lián)系的，因為細胞不是一個獨立的個體，每個細胞之間都可以通過發(fā)送信號進行細胞間的交流，而且細胞間可以通過幾個不同信號系統(tǒng)進行相互聯(lián)系，細胞間通過這種“串話”可以調(diào)節(jié)細胞的生物反應(yīng)，從而影響機體發(fā)育和調(diào)節(jié)體內(nèi)平衡。

3.1 Wnt與其他通路的交聯(lián)

上文提到Wnt信號在影響骨形成方面有重要作用，而研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin與OPG/RANKL/RANK兩通路在影響骨代謝作用中是有相互“串話”， GC可以通過抑制Wnt信號通路的β-catenin來下調(diào)OPG的表達，從而誘導(dǎo)RANKL的生成，而Dkk-1作為Wnt/β-catenin信號的負向調(diào)控因子，在GIOP模型中也可以通過抑制BMSCs向OB分化，進一步減少OPG的表達，上調(diào)RANKL/OPG的比例，促進骨吸收[32]。

另外，Wnt/β-catenin與BMP拮抗GIOP骨量流失過程中通路間也是有相互聯(lián)系的，Wnt可以促進BMSCs不斷分化，成為成骨前體細胞，由于Wnt信號的作用，可以不斷維持細胞的前體狀態(tài)，而BMP卻有促進成骨前體細胞分化為成熟的OB，雖然它們對成骨前體細胞有著相反的作用，但是一旦成骨前體細胞分化成為成熟的OB，Wnt與BMP之間發(fā)生協(xié)同作用，促進OB進一步成熟分化，分泌ALP，加強骨形成?？梢奧nt與BMP之間在骨形成的不同階段分別發(fā)生拮抗或者協(xié)同作用[33]。

Hippo信號通路也是影響骨代謝的一個重要通路，TAZ (transcriptional co-activator with PDZ-binding motif) 是 Hippo信號下游的一個激活因子。研究發(fā)現(xiàn)，GC可以促進TAZ的表達，且TAZ對Wnt/β-catenin通路有抑制作用，通過促進β-catenin的磷酸化降解，抑制catenin轉(zhuǎn)位入核與啟動靶基因的結(jié)合，從而抑制了骨形成[34]。

雖然Wnt/β-catenin作為經(jīng)典的骨代謝通路，已經(jīng)有大量的基礎(chǔ)和臨床相關(guān)的研究，但Wnt/β-catenin通路靶向因子多，與其他通路關(guān)鍵因子的crosstalk調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，在未來仍有一定的研究潛力。

3.2 自噬與其他通路的交聯(lián)

高燕等[35]探討了自噬與BMPs間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)BMP-2能有效促進細胞株C2C12、MC3T3-E成骨分化，成骨分化指標ALP、SP7等增高，與此同時，自噬標志物L(fēng)C3-Ⅱ和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ反映的自噬水平也隨著成骨分化而先增強后減弱。而3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)是一種不依賴mTOR通路的自噬抑制劑，當(dāng)其作用在C2C12、MC3T3-E細胞時，隨著水平增高，細胞成骨分化明顯受抑制，ALP的表達降低，而這很可能是BMP-2受體被阻斷所造成的。

另有學(xué)者也研究了自噬與OPG/RANKL/RANK通路之間的相關(guān)聯(lián)系，利用RANKL誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞RAW264.7分化為成熟OC，而在此過程中自噬相關(guān)標志物L(fēng)C3-Ⅱ表達增多，這表明自噬參與了RANKL所誘導(dǎo)的破骨分化過程[36]。

可見自噬在成骨和破骨的通路調(diào)控中都有一定作用，但由于3-MA可能存在著非特異性，若能對其自噬相關(guān)基因進行敲除研究，可以提供更明確的證據(jù)。

3.3 miRNA與其他通路的交聯(lián)

miRNA作為一種新型的調(diào)控因子，也參與和其他信號通路的“串話”，研究[37]發(fā)現(xiàn)，GC促進miR-214的表達，且利用BMP-2誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的過程中，miR-214作為OSX通路的抑制劑參與了調(diào)節(jié)，抑制了OB形成。miR-29 a通過Wnt信號通路促進OB分化，加強骨細胞形成，能有效拮抗GC所造成的骨量流失[38]。細胞成骨分化過程中，發(fā)現(xiàn)miR-27通過激活與骨形成關(guān)系密切的Wnt信號通路促進hFOB1.19的成骨分化。證實了腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白(APC) 為miR-27的靶基因。APC通過作用其靶點β-catenin，涉及對 Wnt 信號通路的調(diào)控。miR-27通過抑制APC表達，促進β-catenin的高表達，從而正向調(diào)控了成骨分化[39]。

miRNA和自噬對細胞的調(diào)控對維持人體骨量平衡有重要作用，miRNA能夠調(diào)節(jié)包括自噬在內(nèi)的許多細胞進程，而細胞的自噬在維持miRNA內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定發(fā)揮一定作用，兩者之間有一定的聯(lián)系[40]。You等[41]研究發(fā)現(xiàn)，miR-378的過度表達可以抑制成骨分化，而這很可能是通過自噬相關(guān)通路PI3K-Akt所完成的。而Sun等[42]也發(fā)現(xiàn)miR-20 a能作用于巨噬細胞時，能明顯下調(diào)LC3、Beclin1等自噬相關(guān)標志物的表達，可見兩通路間的交聯(lián)對調(diào)控骨代謝有一定作用，但兩者之間的“串話”對GIOP的形成機制仍不明確。

4 小結(jié)

尋找GIOP相關(guān)分子信號通路上的作用靶點并進行相關(guān)的靶向治療，是有效防治GIOP的重要途徑。目前對GIOP的發(fā)病相關(guān)分子信號通路的研究不斷深入，從最開始的Wnt/β-catenin、OPG/RANKL/RANK等經(jīng)典信號，到近年來對自噬、非編碼RNA和crosstalk的研究。各個通路間相互聯(lián)系，相互作用，共同構(gòu)成了調(diào)控GIOP發(fā)病的信號網(wǎng)絡(luò)。然而，我們目前的研究層面很可能只是這個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的冰山一角，許多通路和調(diào)節(jié)因子的研究仍處于起步階段，大部分通路研究也僅局限于單一信號通路，雖然現(xiàn)有研究證實部分通路間的crosstalk能夠調(diào)控GIOP的發(fā)生，但具體機制很多仍未闡明。

但是，由于信號通路的作用位點明確，而針對信號通路的靶向治療效果也更精確。因為通路間并非是完全獨立的，這使得未來GIOP的治療變得更加復(fù)雜。為獲得更為有效、安全的GIOP靶向治療藥物，針對目前的研究現(xiàn)狀，仍需要更多的基礎(chǔ)及臨床實驗研究，探究各種新型靶向藥物之間的相互作用，為臨床實踐提供更多可靠的偱證醫(yī)學(xué)證據(jù)。