陳德龍 陳鵬 鄧章榮 姜山 王粵淇 王海彬

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

近年來(lái)，組織工程學(xué)應(yīng)用于骨組織再生和修復(fù)方面顯示了巨大的前景，而成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及干細(xì)胞在其中發(fā)揮著重要的作用。正常骨組織由骨細(xì)胞和骨基質(zhì)共同組成，通過(guò)骨重塑來(lái)維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡及自身結(jié)構(gòu)的完整，其中成骨細(xì)胞(骨形成功能)和破骨細(xì)胞(骨吸收功能)之間的動(dòng)態(tài)平衡是骨重塑過(guò)程中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。2007年，Valadi等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分泌的外泌體中含有生物活性mRNAs、microRNAs(miRNAs)、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，這使得研究人員對(duì)外泌體的研究熱情激增。隨著研究的進(jìn)展，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)外泌體在細(xì)胞間通訊及局部微環(huán)境的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著特殊作用，因此本文對(duì)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及干細(xì)胞分泌的外泌體在骨重塑中的作用作一綜述。

1 外泌體的內(nèi)容與功能

1.1 形態(tài)與來(lái)源

外泌體是由細(xì)胞內(nèi)吞系統(tǒng)的多泡體(multivesicular body，MVB) 與細(xì)胞膜融合后以外分泌的形式釋放到細(xì)胞外，直徑為 30 ～100 nm 的細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)[1,2]。透射電子顯微鏡下外泌體呈扁平狀或球狀[3]，在蔗糖溶液中的密度為1.13 ～1.19 g/mL， 其密度與細(xì)胞來(lái)源相關(guān)，并隨蛋白含量而改變[4]。外泌體最早由Johnstone等[5]在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞轉(zhuǎn)變過(guò)程中發(fā)現(xiàn)。后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，不僅網(wǎng)織紅細(xì)胞能釋放這種小囊泡，幾乎所有類型的活細(xì)胞都能分泌，例如T細(xì)胞[6]、巨噬細(xì)胞[7]、肥大細(xì)胞[8]、內(nèi)皮細(xì)胞[9]、施旺細(xì)胞[10]、神經(jīng)細(xì)胞[11]、腫瘤細(xì)胞[12]等。

1.2 外泌體的內(nèi)容

外泌體含有蛋白質(zhì)和核酸，Valadi等在2007年發(fā)現(xiàn)外泌體中含有RNA。同時(shí)，外泌體中包含了多種多樣來(lái)源于其分泌細(xì)胞的成分，包括蛋白、脂質(zhì)(lipids)、mRNAs和microRNAs(miRNAs)。多種細(xì)胞來(lái)源的exosomes內(nèi)均包含mRNA和miRNA，并且諸多研究已證實(shí)它們?cè)趀xosomes參與細(xì)胞之間信息傳遞的作用機(jī)制中確實(shí)起到重要作用。根據(jù)一個(gè)專門收錄與exosomes研究相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù) ExoCarta (http: //www．exocarta．org /) 中的信息，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的exosomes相關(guān)蛋白質(zhì)有41 860種，RNA的種類超過(guò)7540和有1 116種脂質(zhì)分子[13]。外泌體的組成與細(xì)胞來(lái)源相關(guān)，不同種類的細(xì)胞外泌體的組成不盡相同[14]。外泌體蛋白質(zhì)的組成與細(xì)胞類型和組織特征相關(guān)，已通過(guò)Western印跡、熒光激活細(xì)胞和電子顯微鏡進(jìn)行了廣泛的分析。外泌體富含熱休克蛋白(HSP70，HSP90)[15]和膜聯(lián)蛋白(膜聯(lián)蛋白Ⅰ，Ⅱ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ和Ⅺ)，有助于膜運(yùn)輸和融合[16]。外泌體也富含運(yùn)輸?shù)鞍?，如微管蛋白、肌?dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白結(jié)合分子[17]以及與分泌細(xì)胞特定功能相關(guān)的幾種蛋白質(zhì)[15]，如MHC II(抗原呈遞細(xì)胞分泌的)[18]和CD86(抗原呈遞細(xì)胞)[19]。此外，外泌體含有高濃度的跨膜4蛋白家族(CD9、CD63、CD81)和腫瘤易感基因101(TSG101)[20]。在體外研究發(fā)現(xiàn)，CD9和CD82能抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[21]。

除了蛋白質(zhì)，外泌體還含有脂質(zhì)，DNA, mRNA, miRNA和lncRNA，參與細(xì)胞間信息交流[22]。MiRNAs是非編碼RNA(non-coding RNAs)家族中的重要一員，大約有17～24個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，通過(guò)與目標(biāo)mRNA上的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)結(jié)合來(lái)調(diào)控翻譯后的基因沉默，進(jìn)而抑制相關(guān)基因的表達(dá)[23]。miRNAs 是外泌體中的主要小RNA，當(dāng)其他細(xì)胞“吞入”這些含有 RNA 的外泌體后，mRNA可以在受體細(xì)胞中翻譯出相應(yīng)的蛋白質(zhì)，microRNA 通過(guò)降解mRNA或者抑制mRNA的翻譯來(lái)調(diào)控蛋白質(zhì)在目標(biāo)細(xì)胞中的表達(dá)，而siRNA可以敲除受體細(xì)胞中的目標(biāo)基因達(dá)到基因沉默的作用。這種運(yùn)輸模式使外泌體中的miRNA可抵抗來(lái)自RNAase的降解作用[24]。外泌體第二主要RNA為lnRNAs(長(zhǎng)非編碼RNA，>200 bp)，通過(guò)用基因組DNA退火或修飾組蛋白復(fù)合物干擾基因表達(dá)[25]。在微環(huán)境中，外泌體表現(xiàn)為介導(dǎo)RNA的載體并遞送其內(nèi)容物和調(diào)節(jié)受體細(xì)胞蛋白的產(chǎn)生。

1.3 生物學(xué)功能與作用

外泌體為細(xì)胞間通訊的載體，并且在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)輸脂質(zhì)、核酸(mRNA和miRNA)和蛋白質(zhì)，可以在受體細(xì)胞中引起生物學(xué)反應(yīng)和表達(dá)內(nèi)容物生物學(xué)效應(yīng)[26]。外泌體和其他生物囊泡之間的主要特征之一是存在大量的核苷酸。外泌體miRNA在雙重脂質(zhì)膜保護(hù)下可以避免RNA酶降解，保持其生物活性，并穩(wěn)定存在于體液(血液，唾液，尿液)中[27-29]，可作為早期發(fā)現(xiàn)疾病的生物標(biāo)志物。此外，外泌體通過(guò)無(wú)創(chuàng)的方式獲得，有利于臨床的推廣與運(yùn)用。

近年來(lái)，越來(lái)越多地報(bào)道間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)分泌的外泌體作為主要的治療劑，但是，目前干細(xì)胞分泌的外泌體缺乏臨床運(yùn)用的報(bào)道，卻在再生醫(yī)學(xué)中已經(jīng)表現(xiàn)出未來(lái)的潛力。

2 外泌體與骨重塑

2.1 促進(jìn)成骨及血管化

體細(xì)胞(間充質(zhì)干細(xì)胞及骨細(xì)胞)來(lái)源的外泌體在骨重塑中起著重要的作用。Xu等[30]發(fā)現(xiàn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)分泌的外泌體miRNAs在骨重塑的過(guò)程中存在明顯表達(dá)差異(let-7 a，miR-135b，miR-148 a，miR-199b，miR-203，miR-218，miR-219，miR-299-5p和miR-302b)，從另一方面表明了干細(xì)胞調(diào)控骨重塑的機(jī)制。其中外泌體miR-196 a通過(guò)調(diào)控成骨基因ALP，OCN，OPN 和Runx2的表達(dá)促進(jìn)成骨分化進(jìn)而促進(jìn)骨折愈合。而且，人臍帶來(lái)源間充干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells hUCMSCs)分泌的外泌體可以啟動(dòng)hBMSCs的成骨分化，并且上調(diào)骨形成相關(guān)基因的表達(dá)，包括ALP，BMP2，OCN，Osterix，Col1α和Runx2[31]。更令人欣慰的是，外泌體還能促進(jìn)生物材料的成骨作用[32]。Zhang等[33]報(bào)道外泌體通過(guò)PI3K/AKT通路增加β磷酸三鈣(β-TCP)的成骨誘導(dǎo)能力。不僅如此，外泌體還能促進(jìn)血管生成進(jìn)一步促進(jìn)骨形成。人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)來(lái)源的間充干細(xì)胞分泌的外泌體能具有顯著促進(jìn)血管生成的能力，進(jìn)一步增加細(xì)胞的增殖能力、上調(diào)成骨相關(guān)基因OPN，RUNX-2和COL1 在基因和和蛋白水平的表達(dá)[34]。而且，在體內(nèi)顱骨骨缺損大鼠模型中，hiPSC-MSC-Exos +β-TCP復(fù)合支架通過(guò)增強(qiáng)血管的新生達(dá)到促進(jìn)顱骨缺損的骨再生[33]。

2.2 抑制骨形成

作為細(xì)胞間通訊的介質(zhì)，外泌體在抑制骨形成中的作用表現(xiàn)為降低成骨細(xì)胞功能和促進(jìn)破骨細(xì)胞活性兩方面。文獻(xiàn)報(bào)道[35]，骨質(zhì)疏松患者的血清中，外泌體中MiR-214和ephrinA2水平呈高表達(dá)狀態(tài)，這有可能顯著抑制了成骨細(xì)胞活性加重病情；在骨性關(guān)節(jié)炎的病理變化中，炎癥細(xì)胞通過(guò)促進(jìn)破骨細(xì)胞衍生的外泌體miR-214-3p的轉(zhuǎn)移，來(lái)抑制成骨細(xì)胞的功能，進(jìn)一步促進(jìn)關(guān)節(jié)下骨的侵蝕[36]。外泌體對(duì)破骨細(xì)胞的影響同樣受到廣泛重視。破骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡含有l(wèi)et-7e，miR-21，miR-155，miR-210，miR-223和miR-378[37]。MiR-223抑制核因子I-A(NFI-A)的表達(dá)并控制破骨細(xì)胞分化。 NFI-A水平的下調(diào)影響M-CSFR的表達(dá)，這對(duì)于破骨細(xì)胞分化和功能至關(guān)重要[38]。MiR-210通過(guò)抑制TGF-β /activin信號(hào)通路和靶向AcvR1b受體調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化[39]。MiR-155，干擾素-β誘導(dǎo)的miRNA，通過(guò)靶向SOCS1和MITF兩個(gè)破骨細(xì)胞形成的基本調(diào)節(jié)因子，抑制破骨細(xì)胞分化[40]。在MSC成骨分化過(guò)程中，MiR-21表達(dá)會(huì)被TNF-α抑制，而阻斷TNF-α可以顯著增強(qiáng)miR-21的表達(dá)和增加骨形成，并且抑制了Spry1的表達(dá)，這是FGF和ERK-MAPK信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子[41]。

3 總結(jié)

外泌體作為機(jī)體內(nèi)普遍存在的納米級(jí)、扁平狀、雙層脂膜結(jié)構(gòu)，廣泛參與細(xì)胞間的交流。成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及干細(xì)胞分泌的外泌體在骨重塑過(guò)程的動(dòng)態(tài)耦聯(lián)平衡起著至關(guān)重要的作用，可為臨床治療骨缺損、骨不連、骨質(zhì)疏松等疾病和骨修復(fù)材料的設(shè)計(jì)提供新的方向。但目前外泌體的研究尚停留在體外試驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，缺乏臨床運(yùn)用的報(bào)道。隨著研究的深入，外泌體作為基因分子治療骨科疾病將會(huì)成為新的里程碑。