許紅喜，于治國(guó)，孫曉玉*

(1.黑龍江農(nóng)墾科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，哈爾濱；2.大慶石油管理局農(nóng)場(chǎng)，大慶)

前言 近年來，隨著畜牧業(yè)和胚胎生物技術(shù)的迅速發(fā)展，對(duì)質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的良種胚胎需求量越來越大，單憑超數(shù)排卵獲得的胚胎已不能滿足科研與生產(chǎn)的需要。牛體外受精技術(shù)越來越受到重視，該技術(shù)不僅能加快供體牛優(yōu)良遺傳性狀繁育進(jìn)程，且可以保存優(yōu)良品種供體牛并使其得到擴(kuò)繁。根據(jù)本人產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)雪龍黑牛體外胚胎的多年生產(chǎn)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，對(duì)牛體外受精技術(shù)程序的各個(gè)環(huán)節(jié)，即卵母細(xì)胞的獲得、卵母細(xì)胞體外成熟、精子獲能、卵母細(xì)胞體外受精和受精卵體外培養(yǎng)等等關(guān)鍵步驟進(jìn)行研究經(jīng)驗(yàn)，以及國(guó)內(nèi)外對(duì)牛體外受精技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)歸納。

1 卵丘細(xì)胞卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)獲得

1.1 屠宰采卵

屠宰采卵方法是將在屠宰場(chǎng)切下來的卵巢放入30～35℃滅菌的PBS(含有1UI.mL-1青霉素/鏈霉素)中,1小時(shí)內(nèi)保溫帶到實(shí)驗(yàn)室，用35～36℃滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，用無菌剪刀去除多余的脂肪組織和皮質(zhì)等，用75%酒精洗滌1次，再用PBS液反復(fù)洗滌3次，抽取卵母細(xì)胞培養(yǎng)。1.3用5 mL一次性注射器、用18G的針頭抽取直徑2～6 mm卵泡，將抽吸的卵泡液注入14 mL滅菌收集管內(nèi)，靜置10 min，用5 mL移液器吸取下層沉淀，移入大培養(yǎng)皿中，靜止2 min后，在體視顯微鏡下用撿卵針撿出卵母細(xì)胞卵丘細(xì)胞復(fù)合體(COCs)放到成熟培養(yǎng)液中洗滌3～5次[1]。

1.2 活體采卵

活體采卵有盲采法、內(nèi)窺鏡法和B型超導(dǎo)引法三種，目前B超導(dǎo)引法己經(jīng)成為國(guó)際上最主要的活體采卵方法之一,荷蘭的pieterse首先利用超聲波技術(shù)B超通過陰道壁從活體牛卵巢采到卵母細(xì)胞。國(guó)外很多學(xué)者對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了廣泛深入的研究。B型超聲波導(dǎo)引法主要利用不同組織對(duì)高頻聲波吸收和反射強(qiáng)度不同的原理,當(dāng)探頭在陰道彎隆處與卵巢接觸時(shí),黃體、卵泡和卵巢結(jié)構(gòu)在屏幕上顯示明暗不同的圖像，卵泡呈大小不同邊緣清晰的黑色圓形圖像，黃體的圖像一般比卵泡的圖像大，且邊緣不太清晰卵巢實(shí)質(zhì)呈灰白色穿刺針呈亮白色，操作者據(jù)此進(jìn)行采卵操作[2]。

2 卵丘細(xì)胞卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)體外成熟培養(yǎng)

判定牛卵母細(xì)胞體外成熟方法有3種，分別為卵丘細(xì)胞擴(kuò)展分級(jí)法、形態(tài)學(xué)觀察第一極體排放法和固定染色觀察法[12]。荷蘭2001年De Wit研究了成熟培養(yǎng)液中加入6 mM尿素，因?yàn)檫@個(gè)濃度是日糧高蛋白的奶牛血液中的生理濃度，培養(yǎng)牛卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞復(fù)合體，在培養(yǎng)8h染色觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞核生發(fā)泡破裂染色體濃縮細(xì)胞減數(shù)分裂MI期的比例高于沒加尿素的，但是染色體分離和第一極體排出受到抑制[3]。M.Rerat體外胚胎生產(chǎn)卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液為0.95 g/100 mLM199(Sigma)，0.22g/100 mL NaHCO3(Sigma)，15% 胎牛血清，5 IU/mL hCG，PG600,青鏈霉素60IU/mL[5]。有研究認(rèn)為牛卵母細(xì)胞體外成熟液中添加β-巰基乙醇，隨著β-巰基乙醇濃度的提高，對(duì)卵母細(xì)胞成熟率有提高的趨勢(shì),對(duì)卵裂率和囊胚率無顯著影響,但顯著提高了胚胎發(fā)育速度[9]。朱淑文研究2%CO2濃度下培養(yǎng)卵母細(xì)胞囊胚發(fā)育率高于5%CO2濃度[10]。

3 卵丘細(xì)胞卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)的體外受精

分離死精和卵黃等精液保護(hù)液方法有BO上浮法和Percoll法純化，研究表明Percoll法處理精子更簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、精子回收率高和精液潔凈。Percoll不連續(xù)密度梯度液是在10 mL離心管中先加入90% Percoll液2 mL，然后加入45% Percoll液2 mL配得，置于CO2箱中平衡1～2 h，冷凍精液在39℃水浴中解凍后,置于經(jīng)平衡Percoll液上，400 g離心5～40 min后，棄掉上清液，底部精子團(tuán)用5 mLSP-TALP液稀釋[13]，Percoll法能顯著提高卵母細(xì)胞的卵裂率，受精液多用TCM199、TALP以及獲能物質(zhì)肝素、咖啡因等，9 h的精卵體外孵育時(shí)間已經(jīng)能夠獲得良好的卵裂率和囊胚率[9]。性控胚胎生產(chǎn)是應(yīng)用優(yōu)質(zhì)種公牛的精液經(jīng)流式細(xì)胞儀分離XY精子，再進(jìn)行精子純化和獲能，精卵體外孵育，獲得牛性控胚胎[4]。

4 受精卵的體外培養(yǎng)

研究在成熟液中加入表皮生長(zhǎng)因子EGF對(duì)牛卵母細(xì)胞的體外成熟和受精后的早期胚胎的發(fā)育都有促進(jìn)作用，在一定范圍內(nèi)增加EGF濃度不會(huì)提高受精率和囊胚率，受精液中加入一定濃度谷胱甘肽GSH 能夠提高受精率和囊胚率，但是在高濃度的GSH時(shí)則影響受精率[8]。劉新峰研究了以受精液為 TALP液, 受精卵培養(yǎng)液為 60% TALP液 + 40%M-199液+ 5% FCS的過渡培養(yǎng)體系能夠提高牛體外成熟卵母細(xì)胞的受精率和卵裂率[5]禹學(xué)禮等研究了牛卵泡液(BFF)濃度、顆粒細(xì)胞單層(GCM)和培養(yǎng)微滴大小對(duì)牛卵母細(xì)胞體外發(fā)育潛力的影響得出與未添加BFF的對(duì)照組相比,成熟培養(yǎng)液中分別加入10%,20%和40%的混合BFF,均可明顯促進(jìn)卵母細(xì)胞受精后的發(fā)育，但20%組和40%組出現(xiàn)卵母細(xì)胞或胚胎粘連。成熟培養(yǎng)液中以添加10%的混合BFF較為適宜。添加GCM對(duì)1級(jí)卵母細(xì)胞的卵裂率、6～8細(xì)胞發(fā)育率和囊胚率無顯著影響，但添加GCM的2級(jí)、3級(jí)卵母細(xì)胞受精后的卵裂率、6～8細(xì)胞發(fā)育率和囊胚率分別顯著高于未添加組。(3)將取自每頭牛的約20枚卵母細(xì)胞，分別置于不同大小的微滴(30、50、100和200 μL)中培養(yǎng)，30和50 μL組的囊胚發(fā)育率顯著高于100和200 μL組[10]。J. Xu研究100 μL微滴卵裂率和囊胚發(fā)育率都高于50 μL，他總結(jié)說50和100 μL組都放了25枚卵子，受精率和囊胚發(fā)育率不同取決于精子在微滴中的終濃度和精卵比例[6]。卵母細(xì)胞和精子的來源和質(zhì)量是該技術(shù)程序的限制性因素，受低營(yíng)養(yǎng)的供體母牛產(chǎn)生劣質(zhì)卵子、先收集卵子有過早成熟的趨勢(shì)和較高的不穩(wěn)定性、年幼或年老的供體母牛產(chǎn)生劣質(zhì)卵子，以及各批次、各管精液存在著受精能力的差異等許多因素都會(huì)影響體外胚胎的數(shù)量和質(zhì)量。

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