彭 帥， 付保強(qiáng)， 鄭天宇， 陳 朗， 朱喬峰， 劉麗霞

(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)作為動(dòng)物機(jī)體重要的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors)，由Medzhitov等首次在人類身上發(fā)現(xiàn)并克隆[1]，因其胞外段與果蠅Toll蛋白同源而引起人們的廣泛關(guān)注，迄今為止已有10余個(gè)家族成員[2]，其中TLR2多位于免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)表面，是一種跨膜糖蛋白，能識(shí)別病原微生物細(xì)胞壁中特定成分(肽聚糖、脂磷壁酸和脂多糖等)，再把病原微生物入侵信號(hào)傳遞入細(xì)胞內(nèi)，激起機(jī)體的免疫應(yīng)答。

1 牛TLR2基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

牛的TLR2基因位于17號(hào)染色體上，mRNA序列總長(zhǎng)3 513 bp，共有2個(gè)外顯子，其CDS區(qū)位于外顯子2上，長(zhǎng)為2 355 bp，編碼784個(gè)氨基酸[3]。TLR2胞外段富集亮氨酸重復(fù)序列(Leucine- richrepeats，LRR)，可以輔助識(shí)別病原體；胞內(nèi)段被稱為TLR結(jié)構(gòu)域(Toll/IL-1R)，其與人類白細(xì)胞介素1受體(IL-1R)胞質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)相似。牛TLR2可通過NF-Κb途徑誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-1β的產(chǎn)生[4]。周峰等對(duì)TLR2跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明TLR2可能是由胞外區(qū)(1 aa～587 aa)，跨膜區(qū)(588 aa～610 aa)，胞內(nèi)區(qū)(611 aa～784 aa)三部分組成的膜蛋白[5]。TLR2作為TLRs的家族成員之一，其活性居于前列，幾乎在所有組織中表達(dá)，并且在脾臟中有高表達(dá)現(xiàn)象[6]，離體培養(yǎng)的不活躍乳腺成纖維細(xì)胞也可以表達(dá)TLR2[7]。

2 牛TLR2基因作用及調(diào)控機(jī)理

牛TLR2基因是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可識(shí)別并結(jié)合對(duì)應(yīng)的病原相關(guān)的分子模式(PAMPs)，比如革蘭氏陽性菌的肽聚糖、脂磷壁酸以及革蘭氏陰性菌的脂多糖、類脂A等，PAMPs來源各不相同，但其化學(xué)本質(zhì)基本相同，即糖脂結(jié)構(gòu)，PAMPs可以將病原體入侵信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)部，誘導(dǎo)并激活特定的免疫效應(yīng)分子(如炎癥細(xì)胞因子)表達(dá)，從而啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答[8]。TLR2還可以控制由細(xì)菌脂蛋白(BLP)引起的細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)-氧化氮依賴性殺菌活性以及促進(jìn)免疫細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)成熟和膜表面分子表達(dá)等。

牛TLR2配體識(shí)別過程比較復(fù)雜，主要通過與TLR1/2結(jié)合形成異源二聚體來識(shí)別對(duì)應(yīng)配體,并且其自身結(jié)合的同型二聚體不能激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。配體包括PAMPs內(nèi)源性分子和合成性激動(dòng)劑[9]。TLR2與TLR6形成的異源二聚體可識(shí)別病原微生物的肽聚糖，與TLR1結(jié)合可識(shí)別細(xì)菌的脂多糖。隨后研究中發(fā)現(xiàn)，沒有TLR1、TLR2的參與，TLR2也能激活免疫效應(yīng)，說明TLR2在體內(nèi)具有很強(qiáng)的生物活性，還可與其他TLRs結(jié)合或與其他物質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng)，如CD14便可與TLR2結(jié)合并產(chǎn)生活性[10]。

牛TLR2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)由許多分子共同參與進(jìn)行，由MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和MyD88非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑組成，且相互依存[11]。PAMPs作用于TLR2，信號(hào)通過胞內(nèi)段的TLR結(jié)構(gòu)域進(jìn)而與MyD88結(jié)合，激活MyD88與白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶(IRAK)的死亡結(jié)構(gòu)域發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致IPAK磷酸化后與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子的合成和釋放。

3 牛TLR2的研究現(xiàn)狀

近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)牛TLR2基因做了大量分子水平上的研究，為牛抗病育種提供了強(qiáng)有力的理論依據(jù)。張翠霞等對(duì)荷斯坦牛TLR2基因進(jìn)行了遺傳多態(tài)性分析，結(jié)果表明其存在3個(gè)單核苷酸突變，但都保持著中低度多態(tài)[12]。林寶山等建立了檢測(cè)牦牛TLR2基因mRNA含量的熒光定量PCR，研究發(fā)現(xiàn)TLR2基因在牦牛小腸中表達(dá)量最高[13]。Zheng等研究表明，在牛腸中，TLR2可識(shí)別并結(jié)合微小的隱孢子蟲[14]。Bhaladhare等發(fā)現(xiàn)牛TLR2存在3個(gè)SNP位點(diǎn)[15]。Zhao等對(duì)荷斯坦牛TLR2進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)新突變位點(diǎn)[16]。楊永江等篩選出6個(gè)荷斯坦牛TLR2基因的SNP位點(diǎn)[17]。

牛TLR2與乳腺炎、結(jié)核病、子宮內(nèi)膜炎等疾病有關(guān)聯(lián)，尤其是與奶牛乳腺炎具有密切的關(guān)聯(lián)。Goldammer等選用逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法分離純化出TLR2基因的mRNA，進(jìn)一步利用原位雜交和熒光PCR研究發(fā)現(xiàn)，在奶?；既橄傺讌^(qū)TLR2基因mRNA的轉(zhuǎn)錄量與不患乳腺炎區(qū)的轉(zhuǎn)錄量差異顯著，表明TLR2基因與奶牛乳腺炎有關(guān)聯(lián)[18]。馬騰壑等應(yīng)用酶切技術(shù)對(duì)荷斯坦牛TLR2基因進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果表明，第2外顯子上有3個(gè)突變位點(diǎn)，但只有一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生氨基酸的變化，并與乳腺炎抗性有關(guān)聯(lián)[19]。白杰等以中國(guó)荷斯坦牛和新疆褐牛作為研究對(duì)象，對(duì)TLR2基因外顯子2進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)篩選并進(jìn)行體細(xì)胞評(píng)分，研究發(fā)現(xiàn)TLR2基因有3個(gè)SNP位點(diǎn)[20]，且乳腺炎和體細(xì)胞評(píng)分之間的遺傳相關(guān)性保持在0.3～0.98之間[21]。周峰等對(duì)南陽黃牛TLR2基因進(jìn)行研究，結(jié)果表明6個(gè)SNP位點(diǎn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，表現(xiàn)出與牛結(jié)核病有關(guān)聯(lián)[22]。孫麗萍等研究表明，牛TLR2存在3個(gè)突變位點(diǎn)，且嚴(yán)重感染乳區(qū)TLR2表達(dá)量明顯增加，說明其與乳腺炎有關(guān)聯(lián)[23]。董慧敏等對(duì)奶牛子宮注射金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液，注射后子宮中TLR2的mRNA表達(dá)量顯著增加，表明TLR2與子宮內(nèi)膜炎有關(guān)聯(lián)[24]。牛TLR2基因與很多疾病具有較強(qiáng)的相關(guān)性，在牛的免疫應(yīng)答中起著至關(guān)重要的作用，由此可見，牛TLR2基因可作為?？共∮N的候選基因，應(yīng)用于疾病的抗性分子標(biāo)記輔助選擇育種。

4 展 望

隨著時(shí)代的發(fā)展、科技的進(jìn)步，人們熱衷于追求高品質(zhì)牛奶及肉質(zhì)，同時(shí)也意識(shí)到疾病會(huì)導(dǎo)致牛奶和肉質(zhì)中存在大量抗生素、炎癥因子等，嚴(yán)重影響消費(fèi)者的健康。目前將TLR2基因作為功能基因，研究基因本質(zhì)與疾病的相關(guān)性已有大量報(bào)道，研究只證明TLR2基因可以作為預(yù)防疾病的候選基因之一，但研究的深度和廣度還有待加深，如何把分子水平上的研究轉(zhuǎn)化到抗病育種、臨床治療等方面還沒有具體的方法。因此，通過整理歸納前人已有的研究數(shù)據(jù)，可以對(duì)牛TLR2基因進(jìn)行更全面的分析，結(jié)合其多態(tài)性進(jìn)行臨床試驗(yàn)以及抗病育種具有重要意義。