尹恒 王建偉 馬勇 吳毛 華臻 蘇秋菊

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)無(wú)錫附屬醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫 214071 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210038 3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫市人民醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫 214023

在骨骼疾病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，最常用的模式動(dòng)物包括大鼠、小鼠、兔等。傳統(tǒng)的動(dòng)物模型有一系列難以克服的缺點(diǎn)，如造模用藥周期長(zhǎng)、費(fèi)用高、工作量大等，人們?cè)诓粩鄬ふ倚碌膭?dòng)物模型來(lái)克服以上缺點(diǎn)。近年來(lái)，一種新的模式動(dòng)物-斑馬魚(yú)(zebrafish)逐漸進(jìn)入了研究人員的視野。

斑馬魚(yú)是一個(gè)古老的動(dòng)物模型，于上世紀(jì)80年代～90年代初被確立為一種新的模式動(dòng)物。經(jīng)過(guò)近30年的發(fā)展，目前斑馬魚(yú)已成為一種常用的模式生物，也是目前被認(rèn)為可用于提升科研效率的最好的動(dòng)物模型之一。在骨骼疾病研究中，斑馬魚(yú)以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)與生理，提供了一種全新的、高效而靈活的動(dòng)物模型。既往的研究涉及骨質(zhì)疏松與骨代謝、骨發(fā)育、骨再生與修復(fù)、藥物篩選等幾個(gè)方向。更有意義的是，斑馬魚(yú)的兩種形態(tài)——胚胎魚(yú)與成年魚(yú)階段各有完全不同的可研究之處，研究者稱(chēng)之為“一體兩面”的動(dòng)物模型。為了下一步研究的開(kāi)展，作者收集了數(shù)據(jù)庫(kù)中的文獻(xiàn)資料，對(duì)目前斑馬魚(yú)的研究作出簡(jiǎn)要分析綜述。

1 文獻(xiàn)篩選

1.1 文獻(xiàn)來(lái)源

以中文“骨、斑馬魚(yú)”為關(guān)鍵詞,檢索知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普數(shù)據(jù)庫(kù)中的中文文獻(xiàn)；以英文“osteoporosis/osteogenesis，zebrafish”為關(guān)鍵詞，檢索Pubmed、Embase、Web of science數(shù)據(jù)庫(kù)中的英文文獻(xiàn)，時(shí)間區(qū)間選取1990年1月-2017年6月。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①原創(chuàng)性；②論點(diǎn)論據(jù)可靠；③動(dòng)物試驗(yàn)類(lèi)文獻(xiàn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①內(nèi)容重復(fù)的文獻(xiàn)；②綜述類(lèi)文獻(xiàn)。

1.3 篩選結(jié)果

初檢共檢索到573篇含相關(guān)內(nèi)容的文獻(xiàn)。按照納入與排除標(biāo)準(zhǔn)，初篩得到285 篇文獻(xiàn)。經(jīng)過(guò)第二次篩選(閱讀摘要篩選，必要時(shí)全文篩選)，共納入107篇文獻(xiàn)。文獻(xiàn)大體分類(lèi)包括骨質(zhì)疏松方向的文獻(xiàn)28篇，骨代謝方向的文獻(xiàn)18篇，骨發(fā)育方向的文獻(xiàn)36篇，骨再生與修復(fù)方向的文獻(xiàn)11 篇，藥物篩選方向的文獻(xiàn)14篇。此外，在107篇文獻(xiàn)中，涉及胚胎斑馬魚(yú)文獻(xiàn)88篇，成年斑馬魚(yú)文獻(xiàn)26篇；含轉(zhuǎn)基因研究方向文獻(xiàn)12篇。

2 胚胎斑馬魚(yú)模型

2.1 胚胎斑馬魚(yú)骨組織的發(fā)育

與哺乳動(dòng)物一樣, 斑馬魚(yú)存在兩種不同類(lèi)型的骨生成方式[1]：從軟骨支架骨化(軟骨內(nèi)骨化)或直接從間充質(zhì)干細(xì)胞前體骨化(膜內(nèi)骨化)。在胚胎期斑馬魚(yú)體內(nèi)，典型的軟骨內(nèi)骨化的部位包括顱骨和咽弓軟骨，典型的膜內(nèi)骨化包括脊椎與鱗片。在細(xì)胞水平上,斑馬魚(yú)的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞與哺乳動(dòng)物高度相似，因此，胚胎斑馬魚(yú)已被廣泛應(yīng)用于骨組織的發(fā)育研究。Pasqualetti等[2]利用胚胎斑馬魚(yú)評(píng)估鍶對(duì)骨骼發(fā)育的影響，評(píng)估了鍶在胚胎發(fā)生過(guò)程中是否會(huì)影響軟骨發(fā)育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鍶不會(huì)擾亂軟骨組織的發(fā)育。在礦化過(guò)程中，研究者證明了低濃度鍶增加脊椎礦化，而高濃度鍶抑制礦物沉積，認(rèn)為在胚胎成骨形成過(guò)程中，鈣/鍶的比例調(diào)節(jié)了礦化過(guò)程。結(jié)果表明斑馬魚(yú)對(duì)于研究微量營(yíng)養(yǎng)素在組織/器官發(fā)育過(guò)程中的作用是一種很好的動(dòng)物模型。Adams等[3]為了研究COL11A1 在顱面和軸向骨骼發(fā)育中的功能作用，在斑馬魚(yú)身上進(jìn)行了這種基因的復(fù)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示斑馬魚(yú)呈現(xiàn)麥?zhǔn)宪浌腔巍⒓顾魅毕?、魚(yú)體短縮、死亡率增加。該結(jié)果提供了COL11A1對(duì)正常斑馬魚(yú)發(fā)展至關(guān)重要的證據(jù)。作者認(rèn)為斑馬魚(yú)能夠提供一種用于研究人類(lèi)軟骨營(yíng)養(yǎng)不良機(jī)制的復(fù)染動(dòng)物模型，并能建立潛在的治療方法。

2.2 胚胎斑馬魚(yú)骨組織活體染色

骨組織的發(fā)育與重建是一個(gè)完整的動(dòng)態(tài)過(guò)程，研究者很難在其他動(dòng)物模型中觀察到該過(guò)程。胚胎斑馬魚(yú)軀體透明度高，便于直視下觀察。研究者可以采用非侵入式的熒光染色方法進(jìn)行活體染色，并進(jìn)行動(dòng)態(tài)、連續(xù)觀察。目前常用的熒光染料包括鈣黃綠素、茜素紅和槲黃素。染色劑可以直接暴露給藥，通過(guò)滲透作用進(jìn)入到斑馬魚(yú)胚胎中。不同的染色劑可以顯示不同的組織結(jié)構(gòu)，給研究帶來(lái)了極大便利。

鈣黃綠素(calcein)在體內(nèi)專(zhuān)門(mén)與鈣離子結(jié)合，直視下可見(jiàn)綠色熒光色團(tuán)。骨骼主要由包含鈣化的骨基質(zhì)組成，因此鈣黃綠素可用于在胚胎發(fā)育期標(biāo)記骨結(jié)構(gòu)。無(wú)毒性和強(qiáng)熒光信號(hào)使得鈣黃綠素成為活體斑馬魚(yú)骨染色最好的染色劑。Du等[4]跟蹤了鈣黃綠素染色后第1天到第21天的斑馬魚(yú)胚胎骨骼結(jié)構(gòu)，并分析了骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (bone morphogenetic protein-2，BMP2)對(duì)中軸骨發(fā)育的影響。發(fā)現(xiàn)鈣黃綠素染色確實(shí)能夠標(biāo)示鈣化的骨骼結(jié)構(gòu)，并能用于檢測(cè)異常的骨發(fā)育，表明鈣黃綠素染色在斑馬魚(yú)胚胎中觀察骨結(jié)構(gòu)具有相當(dāng)?shù)拿舾行?，以及?duì)有骨結(jié)構(gòu)缺陷的突變體進(jìn)行篩選的有效性。與只標(biāo)示綠色熒光的鈣黃綠素不同，茜素紅(alizarin red)在強(qiáng)光下可見(jiàn)直視下紅染，在熒光燈下可見(jiàn)紅色熒光。茜素紅能夠染色骨鈣化基質(zhì)，通過(guò)對(duì)比阿爾新藍(lán)復(fù)染，用來(lái)區(qū)分軟骨和骨骼。韋英杰等[5]在國(guó)內(nèi)首次利用胚胎斑馬魚(yú)建立骨質(zhì)疏松模型，采用茜素紅對(duì)9dpf斑馬魚(yú)顱骨進(jìn)行染色,以顯微檢測(cè)、數(shù)碼成像方法定量分析骨骼染色區(qū)域，取得了一系列研究成果。槲黃素(quercetin)是一種植物激素，廣泛存在于水果和蔬菜(如洋蔥、蘋(píng)果、葡萄)中，可用于染色骨基質(zhì)。Zhao等[6]使用槲黃素研究胚胎斑馬魚(yú)抗血管生成。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)這種染色劑的活體干預(yù)已對(duì)胚胎發(fā)育和骨生理有影響,因此最好使用其他染色劑。阿爾新藍(lán)(alcian blue)和阿爾新綠(alcian green)用于染色軟骨細(xì)胞周?chē)?xì)胞外基質(zhì)中的蛋白多糖。它可用來(lái)顯示胚胎斑馬魚(yú)和成年魚(yú)復(fù)染軟骨，以此區(qū)分軟骨和骨。Walker等[7]最早開(kāi)發(fā)了一種無(wú)酸的方法，使用阿爾新藍(lán)和茜素紅對(duì)胚胎斑馬魚(yú)軟骨和骨骼進(jìn)行復(fù)染，取得了良好的觀察效果。同時(shí)這種方法還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即可以染色標(biāo)本的PCR基因型。

2.3 胚胎斑馬魚(yú)特異性轉(zhuǎn)基因品系的建立

胚胎斑馬魚(yú)有一系列研究?jī)?yōu)勢(shì)，如胚胎斑馬魚(yú)幾乎完全透明，便于直視觀察；性成熟期約2～3個(gè)月，傳代時(shí)間短，便于繁育；基因可操縱性強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)較為成熟。這些優(yōu)勢(shì)給研究者帶來(lái)了極大的研究便利，并從不同研究角度建立了各種品系的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)。Thomas等[8]在最小信號(hào)通路反應(yīng)因素控制下，使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在胚胎魚(yú)體內(nèi)不同的骨骼細(xì)胞或組織中表達(dá)熒光蛋白，實(shí)現(xiàn)了發(fā)育中的特定細(xì)胞可視化研究。這樣的轉(zhuǎn)基因魚(yú)尤其適用在不同的骨骼細(xì)胞或組織中表達(dá)熒光蛋白。Dale等[9]使用Col2a1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系，比較了兩個(gè)col2a1同系的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)了col2a1b的表達(dá)，只與col2a1a有部分的重疊，并通過(guò)比較基因組序列發(fā)現(xiàn)了一個(gè)小的高度保守的序列(R2)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。Delaurier等[10]在2010年報(bào)道建立了一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系Tg(sp7:EGFP)b1212，用于研究骨骼發(fā)育。在這一轉(zhuǎn)基因品系中，綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表達(dá)重新生成了內(nèi)生的sp7基因表達(dá)，并在胚胎斑馬魚(yú)骨發(fā)育的過(guò)程中產(chǎn)生了內(nèi)生的sp7基因表達(dá)。在成年魚(yú)體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了gfp-陽(yáng)性細(xì)胞，并被發(fā)現(xiàn)與在截肢后重新生成長(zhǎng)的鰭線有關(guān)。該轉(zhuǎn)基因品系為進(jìn)一步研究斑馬魚(yú)的囊泡形成和骨骼發(fā)育及再生提供了必要的工具。Kim等[11]建立了一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，明確地表達(dá)了一種特定于骨胚胎的骨結(jié)構(gòu)，用以區(qū)別軟骨的發(fā)育。研究者在斑馬魚(yú)內(nèi)生的col10a1表達(dá)域內(nèi)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)2-2-kb的啟動(dòng)子區(qū)域col10a1:GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，該標(biāo)記只來(lái)自成骨細(xì)胞，可用于明確骨發(fā)育過(guò)程。杜興華等[12]利用To12轉(zhuǎn)座子和Cre-loxP技術(shù)構(gòu)建Tg(nkx2.3:CreERT2)和Tg(nkx2.3:EGFP-CAAX)轉(zhuǎn)基因魚(yú)品系，發(fā)現(xiàn)敲低bmper、miR-23a的表達(dá)嚴(yán)重影響斑馬魚(yú)的顱面骨發(fā)育，為與咽囊相關(guān)的研究工作提供了重要的工具。

2.4 胚胎斑馬魚(yú)突變體基因篩選

突變基因的鑒定是組織和器官發(fā)育研究中非常重要的一個(gè)方面。通過(guò)突變基因,研究者可以明確目標(biāo)基因在骨正常發(fā)育中的作用。在這類(lèi)研究中,斑馬魚(yú)的一個(gè)特定優(yōu)勢(shì)得以凸顯即使用熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)基因胚胎魚(yú)，使得實(shí)時(shí)監(jiān)控骨發(fā)育成為可能。研究者已進(jìn)行大規(guī)模突變基因篩選，并已確定50多個(gè)與軟骨和骨骼發(fā)育缺陷有關(guān)的突變基因。嬰兒期的廣義動(dòng)脈鈣化是一種致命的人類(lèi)疾病，大多數(shù)病例被認(rèn)為是由外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶-1(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase-1，ENPP1)的突變引起的。一些假黃色瘤(PXE)的病例最近與ENPP1有關(guān)。Apschner等[13]利用斑馬魚(yú)ENPP1突變體證明在皮膚、軟骨、心臟、脊索等組織中，異位礦化是獨(dú)立于典型的成骨細(xì)胞或軟骨標(biāo)記的表達(dá)而發(fā)生的。Eames等[14]使用斑馬魚(yú)突變體來(lái)揭示軟骨細(xì)胞抑制軟骨細(xì)胞的成熟。研究者分離了一組突變基因，減少了軟骨基質(zhì)，并增加了軟骨下骨。位置克隆鑒定了兩種基因，fam20b和xylo三段(xylt1)的損傷，這兩種基因都編碼了前列腺素(prostaglandin，PG)合成酶。超微結(jié)構(gòu)分析顯示變異矩陣組織和突變體中軟骨細(xì)胞肥大的早期細(xì)胞特征。研究發(fā)現(xiàn)fam20b和xylt1參與了PG合成。Gray等[15]描述了三種隱性的斑馬魚(yú)leviathan/col8a1a突變等位基因(m531，vu41，vu105)，它破壞了col8a1a，并導(dǎo)致了胚胎脊索的折疊，從而導(dǎo)致了成年的脊柱畸形。研究表明，在胚胎發(fā)生時(shí)，藥物在胚胎發(fā)生時(shí)的短暫性喪失或抑制利syl氧化酶，足以引起成年后的脊椎融合和脊柱側(cè)凸。

2.5 胚胎斑馬魚(yú)高通量藥物篩選

中藥成分的有效性及安全性得到了日益重視，如何進(jìn)行高通量、快速的篩選，是目前研究人員需要面臨的問(wèn)題。傳統(tǒng)的的動(dòng)物模型在藥物高通量篩選中存在各種弊端，如耗時(shí)長(zhǎng)，成本高等，而體外模型不能完全模擬體內(nèi)環(huán)境，篩選質(zhì)量可信度不高。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究者利用胚胎斑馬魚(yú)這一模型，對(duì)各類(lèi)中藥成分進(jìn)行了大規(guī)模、高通量篩選，具有在體化、微板化、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)、簡(jiǎn)單、高效等優(yōu)勢(shì)。Fleming等[16]2005年首次利用胚胎斑馬魚(yú)開(kāi)發(fā)了一種快速、高通量的活體藥物篩選模型，該模型能夠識(shí)別出在骨骼中產(chǎn)生的代謝作用的藥物，活性維生素D3和間斷性給予甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)會(huì)促進(jìn)骨礦化，而持續(xù)暴露于PTH則會(huì)導(dǎo)致凈骨損失。研究者認(rèn)為該模型具有快速、經(jīng)濟(jì)和遺傳的可追溯性，能夠?yàn)椴溉閯?dòng)物模型提供一種強(qiáng)有力的輔助手段。陳穎等[17]利用受精后1 DPF(days post fertilization，DPF)胚胎斑馬魚(yú)毒性模型評(píng)價(jià)26種常見(jiàn)傷科中藥材的安全性，發(fā)現(xiàn)13種藥味(續(xù)斷等)的水煎液致幼斑馬魚(yú)臟器形態(tài)明顯改變,毒性主要表現(xiàn)為卵黃囊腫大、變形、變黑,心包水腫、出血等,且它們的魚(yú)LC50值較低。其余13種藥味(鹿銜草等),未見(jiàn)魚(yú)臟器毒性,且致魚(yú)死亡濃度高。研究者認(rèn)為斑馬魚(yú)模型具有簡(jiǎn)單、高效、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的優(yōu)勢(shì),使中藥在體毒性規(guī)?；Y選成為可能。

3 成年斑馬魚(yú)模型

胚胎斑馬魚(yú)用于研究骨骼系統(tǒng)的發(fā)育與藥物高通量篩選有著巨大優(yōu)勢(shì)，然而,由于缺乏成熟的骨骼，骨組織的代謝、修復(fù)和重建無(wú)法使用胚胎斑馬魚(yú)進(jìn)行。成年斑馬魚(yú)骨屬性與人類(lèi)相似,提示可能成為用于研究人類(lèi)骨骼疾病的模型，研究者進(jìn)行了不斷探索，目前已復(fù)制出數(shù)個(gè)成年魚(yú)骨病如骨質(zhì)疏松，用于分析病理生理機(jī)制和設(shè)計(jì)新的治療方案。因此,成年斑馬魚(yú)模型是一個(gè)研究骨代謝和骨轉(zhuǎn)換重要的模型。人們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn),成年斑馬魚(yú)的魚(yú)鰭和鱗片各自代表具有獨(dú)立特征的模型。

3.1 成年斑馬魚(yú)模型的檢測(cè)方法

成年斑馬魚(yú)體長(zhǎng)約3～4 cm，體表覆蓋鱗片。在骨骼疾病研究中，鱗片、脊柱、尾鰭是最常用的研究部位，常用的觀察方法如組織提取檢測(cè)、特異性染色、顯微觀察、雙能X線、Micro-CT等方法均已常規(guī)開(kāi)展。在過(guò)去的幾年里,斷層技術(shù)如時(shí)間門(mén)控光學(xué)投影斷層分析(TGOPT)被用于成年斑馬魚(yú)來(lái)重建三維內(nèi)部結(jié)構(gòu)，斑馬魚(yú)完整骨骼系統(tǒng)可由μCT掃描,可進(jìn)行全身以及特定骨骼(如脊柱)的骨密度(bone mineral density，BMD)測(cè)定，全身μCT掃描可進(jìn)行斑馬魚(yú)骨骼系統(tǒng)的3D重建以檢測(cè)特殊的膳食(如鍶)補(bǔ)充后不同的骨骼結(jié)構(gòu)顯影，這些檢測(cè)方法為研究提供了便利條件。Pasqualetti等[18]將成年斑馬魚(yú)鱗片進(jìn)行多種染色，發(fā)現(xiàn)鱗片的特定礦化模式和分布在不同區(qū)域的成骨細(xì)胞分布。沿著外環(huán)觀察到，在礦化的過(guò)程中，鱗片邊緣復(fù)染細(xì)胞在礦化過(guò)程發(fā)生之前就會(huì)遷移并組織起來(lái)，表現(xiàn)出堿性磷酸酶活性。內(nèi)環(huán)也以新的矩陣沉積為特征。研究者認(rèn)為斑馬魚(yú)鱗片是分析骨形成和礦化過(guò)程中成骨細(xì)胞行為的一個(gè)非常有效的模型。Kitamura等[19]為研究成骨-破骨細(xì)胞相互作用，將6月齡斑馬魚(yú)鱗片進(jìn)行qPCR檢測(cè)，分析了RANK-RANKL-OPG、semaphorin 4D相關(guān)mRNA，發(fā)現(xiàn)3.0 g負(fù)載振動(dòng)顯著降低了RANKL/RANK功能比，而靜態(tài)3.0 g加速導(dǎo)致了骨吸收mRNA的表達(dá)。Hur等[20]利用Micro-CT檢測(cè)成年斑馬魚(yú)脊椎，進(jìn)行表型組學(xué)研究。在大量的位點(diǎn)上，對(duì)數(shù)以百計(jì)的表型和密度特征進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)與人類(lèi)骨質(zhì)疏松癥有關(guān)的表型和甲狀腺刺激激素受體過(guò)度活躍。Farwell等[21]利用成年斑馬魚(yú)再生尾鰭作為活體模型，觀察TMEM184 A對(duì)再生的血管再生的表達(dá)及影響。在Tmem184a分子的作用下，再生尾鰭產(chǎn)生了混亂的再生血管，這些血管不會(huì)向外生長(zhǎng)，也限制了正常的總鰭的再生。

3.2 骨質(zhì)疏松模型

胚胎斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型目前在國(guó)內(nèi)外得到了廣泛應(yīng)用[22-24]，然而存在如下幾個(gè)問(wèn)題：① 胚胎斑馬魚(yú)骨骼尚未成熟，正常的骨重建機(jī)制尚未完全建立；② 胚胎斑馬魚(yú)的軀體較小，約2～4 mm，目前多采用頭骨染色觀察，其他檢測(cè)方法難以進(jìn)行；③ 藥物，尤其是中藥天然成分的耐受性較差，許多藥物試驗(yàn)難以進(jìn)行。為此研究者近年不斷開(kāi)發(fā)成年斑馬魚(yú)模型用于骨質(zhì)疏松研究。Vrieze等[25]將成年斑馬魚(yú)暴露于含潑尼松龍藥液的水中，取再生的魚(yú)鱗片檢測(cè)礦物質(zhì)含量和破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的骨基因表達(dá)譜。發(fā)現(xiàn)潑尼松龍?zhí)岣吡似乒羌?xì)胞的活性和骨基質(zhì)的吸收，減緩了鈣/磷的摩爾比率的增加，預(yù)示著改變骨礦化過(guò)程。通過(guò)在骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的時(shí)間剖面上的改變，在骨形成和骨吸收的不平衡等方面阻礙再生。研究者認(rèn)為糖皮質(zhì)激素能夠成功誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松斑馬魚(yú)模型，提供一種極其高效的研究工具。尹恒[26]利用成年斑馬魚(yú)建立糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松(glucocorticoid induced osteoporosis，GIOP)斑馬魚(yú)模型，并研究中藥龜鹿二仙膠對(duì)魚(yú)鱗片礦化、骨膠原結(jié)構(gòu)及TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)激素能夠成功誘導(dǎo)出骨質(zhì)疏松的斑馬魚(yú)，而鱗片的檢測(cè)結(jié)果可以為后續(xù)的研究提供一定參考。

成年斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型是一種非常有效的研究工具，具有諸多優(yōu)勢(shì)：①斑馬魚(yú)易飼養(yǎng)、成本低；②暴露給藥方法簡(jiǎn)便，給藥濃度可精確控制；③大幅度縮短造模及給藥干預(yù)時(shí)間，提高研究效率；④分子水平與人類(lèi)相似度高。這些優(yōu)勢(shì)給研究帶來(lái)了極大的便利。與此同時(shí)斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型還有一些亟待解決的問(wèn)題：①目前開(kāi)展的骨質(zhì)疏松模型多采用激素誘導(dǎo)，其病理機(jī)制與原發(fā)性骨質(zhì)疏松并不完全相同，因此研究結(jié)果可能受到影響；②目前斑馬魚(yú)模型的檢測(cè)指標(biāo)不夠統(tǒng)一，不能形成完善的參考體系，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度不高；③目前成年斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松研究中，骨標(biāo)本一般選擇脊柱或鱗片，缺乏骨-血清代謝相關(guān)性研究；④由于斑馬魚(yú)體型的限制，只能進(jìn)行一次性剪尾法采血，難以進(jìn)行連續(xù)性血清學(xué)藥效鑒定。因此，需要開(kāi)展進(jìn)一步的研究來(lái)完善這一模型。

3.3 骨再生與修復(fù)

以尾鰭為代表的成年斑馬魚(yú)部分組織在截肢或受傷后擁有再生的能力。尾鰭由基底部骨骼、放射狀鱗質(zhì)鰭條(骨組織)、軟組織和血管組成[27]。尾鰭的基底部骨骼為軟骨內(nèi)骨化，切除后不能再生。放射狀鱗質(zhì)鰭條不含細(xì)胞，為膜內(nèi)骨化，可實(shí)現(xiàn)完全再生，因此被用于研究成熟骨組織的修復(fù)和再生能力。Sousa等[28]在成年斑馬魚(yú)尾鰭上建立了一個(gè)骨折模型，將骨骼放射狀骨折，對(duì)比截肢模型，發(fā)現(xiàn)損傷反應(yīng)的初始階段與傷口愈合分子標(biāo)記的激活是相同的。然而，在骨折試驗(yàn)中，胚芽的表達(dá)比在截肢后的再生過(guò)程要晚，骨細(xì)胞的沉積和基因的表達(dá)也被延遲。進(jìn)一步研究表明，骨骼和血管也會(huì)受到影響。表明骨折修復(fù)的時(shí)間比截肢后再生的時(shí)間更長(zhǎng)。研究者認(rèn)為這一新模型可能有助于確定控制骨折的關(guān)鍵過(guò)程，并有助于改善人類(lèi)的骨骼修復(fù)。Mahamid等[29]利用同步加速器微光束X射線衍射和小角度散射，結(jié)合低溫掃描電子顯微鏡，研究了斑馬魚(yú)尾鰭組織的連續(xù)礦化過(guò)程。前者提供了礦物相和礦物顆粒大小和形狀的信息，后者則提供了原生水化組織的高分辨率成像。這兩種技術(shù)的整合表明，新的礦物是作為一種無(wú)定形的磷酸鈣納米球的包裹來(lái)運(yùn)送和沉積的，然后在膠原基質(zhì)中轉(zhuǎn)化為結(jié)晶磷灰石骨板。該研究為尾鰭的再生與修復(fù)提供了全新的方向。此外，斑馬魚(yú)尾鰭透明度高，有利于活體染色和放射學(xué)觀察，為研究帶來(lái)了便利條件，目前已有多種轉(zhuǎn)基因品系用于骨再生與修復(fù)。

4 總結(jié)與展望

斑馬魚(yú)以其“一體兩面”獨(dú)特的結(jié)構(gòu)與生理，為骨骼疾病的研究提供了一種全新的、高效而靈活的動(dòng)物模型，經(jīng)過(guò)數(shù)十年的不斷研究，在分子、基因水平均得到了長(zhǎng)足的進(jìn)展，越來(lái)越成為人類(lèi)骨骼疾病基因分析與治療、藥物開(kāi)發(fā)研究方面的重要工具。在中醫(yī)藥研究中，結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)理論，斑馬魚(yú)將成為一種快速、高通量篩選中藥的一個(gè)重要模型，為全面開(kāi)展藥效學(xué)、毒理學(xué)及藥物代謝學(xué)等全方面多角度的研究打下基礎(chǔ)。