李金磊，董 鵬，狄元冉，方忠意，張發(fā)旺，周紅霞，吳志明，高延玲

(河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南鄭州 450008)

腹瀉病是導(dǎo)致發(fā)展中國家兒童發(fā)病和死亡的主要病因之一[1-2]。研究表明，致瀉性大腸桿菌(DiarrheagenicEscherichiacoli，DEC)是導(dǎo)致腹瀉的重要原因[3]。大腸桿菌是寄生于人體腸道和其他溫血動物體內(nèi)的一種無害共生菌[4]。與人類疾病有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，根據(jù)臨床特征、流行病學(xué)和毒性特征可將致瀉性大腸桿菌分為6類：產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicE.coli，ETEC)、典型和非典型腸致病性大腸桿菌(Typical and atypical enteropathogenicE.coli，tEPEC、aEPEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EnteroinvasiveE.coli，EIEC)、腸聚集性大腸桿菌(EnteroaggregativeE.coli，EAEC)、腸黏附性大腸桿菌(Diffusely adherentE.coli，DAEC)和產(chǎn)志賀毒素的大腸桿菌(Shiga-toxin-producingE.coli，STEC)[5-6]。致瀉性大腸桿菌除了能引起急性發(fā)病和死亡外，還能導(dǎo)致嚴(yán)重的后遺癥，如出血性結(jié)腸炎(Hemorrhagic colitis，HC)和溶血性尿毒綜合征(Hemolytic uremic syndrome，HUS)以及營養(yǎng)不良等[3,7]。

近年來，致瀉性大腸桿菌的感染越來越嚴(yán)重，對社會公共安全構(gòu)成了極大威脅。2010年哥倫比亞的加勒比腹瀉兒童中，致瀉性大腸桿菌的檢出率為14.4%[8]，印度在5歲以下腹瀉兒童中的檢出率高達(dá)52.0%[9]，而加納在兒童和成人腹瀉病例中的檢出率分別為77.0%和38.0%[10]。2011年，德國致瀉性大腸桿菌疫情導(dǎo)致3 500多人感染，45人死亡[11]。2013年，我國對1 658份糞便拭子中致瀉性大腸桿菌進(jìn)行檢則，總陽性率為8.93%[12]。

飼料及飼料原料作為畜牧業(yè)的初級投入品，其受到致病菌污染尤其是致瀉性大腸桿菌污染將直接影響畜產(chǎn)品質(zhì)量，危害人類健康。筆者對2015—2016年飼料及飼料原料中致瀉性大腸桿菌的檢出情況進(jìn)行分析，以期引導(dǎo)飼料生產(chǎn)企業(yè)加強(qiáng)管理，提高產(chǎn)品質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株。EIEC CVCC1372、EPEC CVCC1396、ETEC CVCC195，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；菌株EHEC CICC21530購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2樣品。共抽取河南、遼寧、北京、浙江、廣東、黑龍江、內(nèi)蒙古、江西濃縮飼料、配合飼料、動物原料、微生態(tài)制劑、酶制劑463批，具體抽樣情況見表1。

1.1.3試劑。營養(yǎng)肉湯、腸道增菌肉湯均購自北京路橋技術(shù)股份有限公司；5種致瀉性大腸埃希氏菌多重PCR檢測試劑購自北京卓誠惠生生物科技有限公司；Marker DL2000購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；西班牙瓊脂糖購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備低溫可疊放搖床MaxQ SHKE 600-8CE型(美國Thermo scientific公司)；梯度PCR儀LabCycle Standard Plus型(德國SENSO公司)；凝膠電泳成像系統(tǒng)GeiDov XR(美國Bio-Red);拍擊式均質(zhì)器400m型(美國Interscience公司)；臺式高速冷凍離心機(jī)3-18K(德國Sigma公司)；電子天平PL2002型[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；高壓滅菌鍋HVE-50型(日本HIRAYAMA公司)。

1.3方法

1.3.1樣品采集。用一次性手套無菌采集飼料及飼料原料約300 g，裝于無菌自封袋內(nèi)，4 ℃下保存，24 h內(nèi)送回實驗室檢測。

1.3.2增菌。無菌稱取待檢樣品25 g，置于無菌均質(zhì)袋中，加入225 mL營養(yǎng)肉湯，由均質(zhì)器拍打1～2 min，(36±1)℃下培養(yǎng)6 h。挑取1環(huán)，接種于30 mL腸道增菌肉湯內(nèi)，42 ℃下培養(yǎng)18 h。同時，設(shè)置陽性對照和陰性對照。

表1 2015—2016年飼料和飼料原料抽樣數(shù)量統(tǒng)計

1.3.3菌液DNA的提取。采用煮沸裂解法提取樣品DNA。取1 mL上述增菌液，12 000 r/min離心2 min，棄上清。加入1 mL滅菌去離子水重懸，12 000 r/min離心2 min，棄上清。加入100 μL滅菌去離子水重懸，于沸水中煮10 min后取出，12 000 r/min離心2 min。取上清作為PCR擴(kuò)增模板。陽性對照和陰性對照均按照相同方法提取DNA。

1.3.4PCR擴(kuò)增。采用致瀉性大腸埃希氏菌多重PCR檢測試劑盒進(jìn)行PCR檢測。PCR反應(yīng)體系如下：2×PCR Buffer 12.5 μL、10×Multiplex Assay(A211L)2.5 μL、25×PCR Enzyme 1.0 μL、Nuclease-free Water 7.0 μL、模板核酸樣品2.0 μL,總計25.0 μL。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。

1.3.5瓊脂糖凝膠電泳檢測。配制1.2%的瓊脂糖凝膠，且膠的長度不小于10 cm；電壓設(shè)置為10 V/cm；電泳時間為20～30 min。

1.3.6結(jié)果判定。若陽性對照有與設(shè)計長度一致的DNA電泳條帶，且陰性對照無條帶或無特定長度的DNA條帶，則試驗成立，否則試驗不成立；若樣品有與陽性對照一致的DNA電泳條帶，則判定為檢出致瀉性大腸桿菌。

2 結(jié)果與分析

2.1總體檢出情況2015—2016年共檢測飼料及飼料原料463批，檢出致瀉性大腸桿菌陽性樣品12批，陽性率2.6%。其中，EPEC陽性樣品7批，陽性率1.5%；ETEC陽性樣品3批，陽性率0.65%；EHEC陽性樣品2批，陽性率0.43%；未檢出EIEC陽性樣品。部分陽性樣品瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖1。

注：M為Marker DL2000；P為4種致瀉性大腸桿菌陽性對照；S1、S2、S3為陽性樣品Note: M.Marker DL2000；P.positive control of 4 kinds of DEC; S1,S2,S3 were positive samples圖1 部分樣品4種致瀉性大腸桿菌多重PCR檢測電泳圖譜Fig.1 The electrophoretogram for mutiple PCR results of 4 kinds of DEC in some samples

2.2各地區(qū)的檢出情況由表2可知，河南共檢測樣品225批，陽性樣品7批，陽性率3.1%；廣東共檢測樣品60批，陽性樣品2批，陽性率3.3%；北京共檢測樣品30批，陽性樣品1批，陽性率3.3%；遼寧共檢測樣品22批，陽性樣品2批，陽性率9.1%；浙江、黑龍江、內(nèi)蒙古、江西未檢出致瀉性大腸桿菌陽性樣品。

2.3各類樣品的檢出情況由表3可知，共檢測96批酶制劑，其中陽性樣品8批，陽性率8.3%；動物原料138批，陽性樣品2批，陽性率1.4%；濃縮飼料34批，陽性樣品1批，陽性率2.9%；微生態(tài)制劑73批，陽性樣品1批，陽性率1.4%；配合飼料中未檢出陽性樣品。

表2 各地區(qū)致瀉性大腸桿菌檢出情況

3 結(jié)論與討論

近年來，致瀉性大腸桿菌感染給公共衛(wèi)生帶來很大的威脅[5，13]。據(jù)估計，全球范圍內(nèi)每年有超過10億腹瀉病例，導(dǎo)致約200萬人死亡，且腹瀉是導(dǎo)致低收入國家和中等收入國家青少年兒童疾病和死亡的重要病因，而致瀉性大腸桿菌是導(dǎo)致腹瀉的重要原因[14]。研究發(fā)現(xiàn)，致瀉性大腸桿菌在腸道致病菌中居于第3位，檢出率達(dá)5.2%，其中以EPEC為主[3]。致瀉性大腸桿菌很難像沙門氏菌或志賀氏菌一樣通過常規(guī)生化試驗加以區(qū)分，血清分型也不能很可靠地區(qū)分致瀉性大腸桿菌，因此對致瀉性大腸桿菌的檢測需要非常專業(yè)的試驗技術(shù)[15]。

表3 各類樣品中致瀉性大腸桿菌的檢測結(jié)果

筆者于2015—2016年對飼料及飼料原料中致瀉性大腸桿菌進(jìn)行檢測，從463批樣品中共檢出致瀉性大腸桿菌12批，檢出率為2.6%。其中，EPEC陽性樣品7批、ETEC陽性樣品3批，EHEC陽性樣品2批，陽性率分別為1.50%、0.65%和0.43%；從96批酶制劑中檢出陽性樣品8批，陽性率8.3%；從34批濃縮飼料中檢出陽性樣品1批，陽性率2.9%；從138批動物原料中檢出陽性樣品2批，陽性率1.4%；從73批微生態(tài)制劑中檢出陽性樣品1批，陽性率1.4%。這說明飼料及飼料原料中致瀉性大腸桿菌污染比較嚴(yán)重，尤其是濃縮飼料和酶制劑。今后，飼料生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)加強(qiáng)對飼料及飼料原料的生產(chǎn)管理，從源頭做起，嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)，努力提高自檢自控能力，尤其是對濃縮飼料、酶制劑和動物原料的監(jiān)測和控制。

應(yīng)用多重PCR檢測技術(shù)，能夠快速、準(zhǔn)確、高通量地檢測飼料及飼料原料中致瀉性大腸桿菌，對防止食源性疾病的危害，開展主動監(jiān)測和危險性評估進(jìn)而解除致瀉性大腸桿菌對人類的危害具有重要的意義。

[1] LIU L,JOHNSON H L,COUSENS S,et al.Child health epidemiology reference group of WHO and UNICEF:Global,regional,and national causes of child mortality:An updated systematic analysis for 2010 with time trends since 2000[J].Lancet,2012,379:2151-2161.

[2] KOTLOFF K L,NATARO J P,BLACKWELDER W C,et al.Burden and aetiology of diarrhoeal disease in infants and young children in developing countries (the global enteric multicenter study,GEMS):A prospective,case-control study[J].Lancet,2013,382(9888):209-222.

[3] ASSIS F E A,WOLF S,SUREK M,et al.Impact ofAeromonasand diarrheagenicEscherichiacoliscreening in patients with diarrhea in Paraná,southern Brazil[J].J Infect Dev Ctries,2014,8(12):1609-1614.

[4] DUTTA S,PAZHANI G P,NATARO J P,et al.Heterogenic virulence in a diarrheagenicEscherichiacoli:Evidence for an EPEC expressing heat-labile toxin of ETEC[J].International journal of medical microbiology,2014,305(1):47-54.

[5] CROXEN M A,LAW R J,SCHOLZ R,et al.Recent advances in understanding enteric pathogenicEscherichiacoli[J].Clin Microbiol Rev,2013,26(4):822-880.

[6] NATARO J P,KAPER J B.DiarrheagenicEscherichiacoli[J].Clin Microbiol Rev,1998,11(1):142-201.

[7] CAINE L A,NWODO U U,OKOH A I,et al.Occurrence of virulence genes associated with diarrheagenicEscherichiacoliisolated from raw cow′s milk from two commercial dairy farms in the eastern cape province,South Africa[J].Int J Environ Res Public Health,2014,11:11950-11963.

[9] RAJENDRAN P,AJJAMPUR S S R,CHIDAMBARAM D,et al.Pathotypes of diarrheagenicEscherichiacoliin children attending a tertiary care hospital in South India[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2010,68(2):117-122.

[10] OPINTAN J A,BISHAR R A,NEWMAN M J,et al.Carriage of diarrhoeagenicEscherichiacoliby older children and adults in Accra,Ghana[J].Transactions of the royal society of tropical medicine and hygiene,2010,104:504-506.

[11] FRANK C,WERBER D,CRAMER J P,et al.Epidemic profile of Shiga-toxin-producingEscherichiacoliO104:H4 outbreak in Germany[J].N Engl J Med,2011,365(19):1771-1780.

[12] 朱林英,趙冰,黃紅,等.分子診斷技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)分離方法在致瀉性大腸桿菌檢測中的運(yùn)用[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2015,25(4):467-470．

[13] ESTRADA-GARCIA T,NAVARRO-GARCIA F.EnteroaggregativeEscherichiacolipathotype:A genetically heterogeneous emerging foodborne enteropathogen[J].FEMS Immunol Med Microbiol,2012,66(3):281-298.

[14] PATZI-VARGAS S,ZAIDI M B,PEREZ-MARTINEZ I,et al.DiarrheagenicEscherichiacolicarrying supplementary virulence genes are an important cause of moderate to severe diarrhoeal disease in mexico[J].PLoS Negl Trop Dis,2015,9(3):1-18.

[15] JANDA J M,ABBOTT S L.Revisiting bacterial gastroenteritis,Part I:Issues,possible approaches,and an ever-expanding list of etiologic agents[J].Clin Microbiol Newsletter,2010,33(10):71-76.

科技論文寫作規(guī)范——標(biāo)點符號

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