李曉潔 姜俊 朱蓓

[摘要] 目的 探討人質膜型唾液酸酶（Neu3）表達降低對前列腺癌PC-3細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響。 方法 構建pGCsi-Neu3質粒，從GeneBank中尋找符合Neu3 mRNA特異的靶序列，合成siRNA模板鏈后與載體相連接，轉入感受態(tài)細胞，測序鑒定。應用真核細胞轉染技術轉染前列腺癌PC-3細胞，利用熒光顯微鏡檢測轉染效率；細胞增殖實驗檢測pGCsi-Neu3質粒對細胞增殖的影響；流式細胞術檢測細胞凋亡的改變；Transwell遷移、侵襲實驗檢測細胞遷移、侵襲能力的變化。 結果 針對Neu3基因設計了siRNA序列并成功構建pGCsi-Neu3質粒，pGCsi-Neu3-3質粒對基因Neu3的抑制最為有效。與對照組比較，pGCsi-Neu3-3質?？捎行б种颇[瘤細胞增殖（P < 0.01）；pGCsi-Neu3-3質粒可引起前列腺癌PC-3細胞凋亡，凋亡率明顯高于空白對照組（MOCK組），差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；pGCsi-Neu3-3質粒可使前列腺癌PC-3細胞增殖細胞核抗原表達明顯下降；pGCsi-Neu3-3質粒可抑制前列腺癌PC-3細胞遷移、侵襲能力，且與對照組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。結論 針對Neu3基因siRNA表達質粒的構建、鑒定和初始研究，為Neu3對前列腺癌細胞生長、轉移發(fā)揮作用機制的研究奠定實驗基礎。

[關鍵詞] 人質膜型唾液酸酶；前列腺癌；質粒構建；增殖；侵襲

[中圖分類號] R737.25 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）10（a）-0008-05

Influence of down regulation of Neu3′s to PC-3 cell′s proliferation， invasiveness， and its mechanism

LI Xiaojie JIANG Jun ZHU Bei

Department of Basic and Pharmacy， School of Medicine and Technology， Taizhou Polytechnic College， Jiangsu Province， Taizhou 225300， China

[Abstract] Objective To investigate the influence of Neu3 gene silencing in growth inhibition of PC-3 cell and to elucidate the underlying mechanisms. Methods Three pieces of siRNA sequences on the Neu3 gene were designed and then a recombinant plasmid carrying siRNA was constructed， which was used to transfer PC-3 cells in order to screen the most effective sequence among the three siRNA sequences against Neu3； PC-3 cell transfection pGCsi-Neu3 plasmid， inverted microscope was used to observe the transfection efficiency， determined by MTT test their effects on cell proliferation and flow cytometry was used to detect the change of cell apoptosis； Transwell migration and invasion assay were performed to detect the migration and invasion cells of groups. Results The siRNA sequences targeted to Neu3 gene were designed and their expression vectors were cloned and verified successfully. Compared with control group， pGCsi-Neu3-3 plasmid significantly inhibited cell proliferation （P < 0.01）； pGCsi-Neu3-3 plasmid significantly promoted the apoptosis of PC-3 cells of prostate cancer compared with the blank control group （Mock group）， the difference was statistically significant （P < 0.05）. pGCsi-Neu3-3 plasmid could inhibit the migration and invasion assay of PC-3 cells of prostate cancer， compared with the control group， with statistically significant difference （P < 0.01）. Conclusion Construction， identification and initial study of Neu3， might lay the foundation of experiment for the study of growth and metastasis mechanism of prostate cancer cell.

[Key words] Human plasma membrane-associated sialidase； Prostate cancer； Plasmid construction； Proliferation； Migration

DNA損傷后在修復過程中有時會出現(xiàn)錯誤，致使基因突變，如癌基因的激活或過表達[1-2]，抑癌基因的失活或抑癌產(chǎn)物的缺失[3-4]，從而細胞生長失控、分化能力減弱形成單克隆、不斷增生的細胞團——腫瘤。發(fā)病率與年齡密切相關的前列腺癌，在美國位居男性惡性腫瘤的首位。最新統(tǒng)計報告顯示，2016年發(fā)病人數(shù)為180 890人[5]，在中國社會人口老齡化的大背景下其發(fā)病率呈現(xiàn)急劇上升的趨勢[6]。唾液酸酶可降解糖脂和糖蛋白非還原末端的唾液酸[7-8]，目前根據(jù)細胞定位共分為4種亞型——Neu1、Neu2、Neu3、Neu4[9-10]。Neu3主要定位在細胞膜，參與細胞黏附、遷移等生理功能[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)Neu3在前列腺癌中表達增高[13]。此外在肺癌[14]、結腸癌[15]、黑色素瘤[16]、膠質母細胞瘤[17]等多種腫瘤組織中Neu3表達水平也增高[18]。但目前Neu3表達改變是腫瘤發(fā)生的原因還是結果尚不清楚，本研究選取前列腺癌激素非依賴型PC-3細胞作為研究細胞，構建針對Neu3基因的siRNA表達質粒，觀察其對PC-3細胞增殖、遷移過程的影響，為前列腺癌靶向治療探尋新的、潛在的靶點。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

JILSON加樣器、SONY低溫高速離心機、恒溫水浴箱、SANYO CO2恒溫培養(yǎng)箱、分光光度計、SONY自動高壓蒸氣消毒器、YZ-875超凈工作臺、SONY -80℃低溫冰箱。

1.2 主要試劑

IMDM培養(yǎng)液、胎牛血清、Transwell小室（Hyclone公司）；LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）。胰蛋白酶（GBICO美國）；噻唑藍（MTT）細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（Sigma美國）；DL2000 DNA Marker、DL1500 DNA Marker、Taq DNA聚合酶、BamH Ⅰ酶、Hind Ⅲ酶（TAKARA日本）、膠回收試劑盒（TAKARA日本）、Annexin V-FITC/PI試劑盒（Abcom公司）。

1.3 質粒、菌種及細胞系

PC-3細胞購于ATCC，質粒pGCsilencer-U6/Neo/GFP（上海吉凱基因化學有限公司）。菌株JM-109和減毒沙門菌為吉林大學病理生理學實驗室所保存。

1.4 細胞培養(yǎng)

PC-3細胞按ATCC培養(yǎng)條件：用含有100 μg/mL青鏈霉素、10%胎牛血清的IMDM（Hycolone，USA）培養(yǎng)液在37℃含5%CO2孵育箱中，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。

1.5 pGCsi-Neu3重組質粒的構建

1.5.1 Neu3-siRNA模板寡核苷酸的設計 根據(jù)Neu3 mRNA特異的靶序列，合成針對其編碼區(qū)130-149、220-239及839-858位堿基序列的3條DNA寡核苷酸鏈，分別命名為shRNA-Neu3-1、shRNA-Neu3-2和shRNA-Neu3-3，每條正義鏈包括5′末端BamH Ⅰ酶切位點和反向的兩個一致的靶序列（19 bp）。設計時，shRNA模板中的loop結構選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號，shRNA的轉錄終止序列采用T6結構[19]。shRNA-Scramble對照：堿基順序隨機排列，與人類基因的外顯子沒有同源性（實驗室提供）。

1.5.2 pGCsilencer-U6/Neo/GFP載體線性化及回收 使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ兩種內切酶將pGCsilencer-U6/Neo/GFP質粒切開，瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，切取含有線性化質粒的凝膠，按照TAKARA膠回收試劑盒的操作流程說明書進行回收，采用λDNA Marker做標準品對線性化質粒定量。

1.5.3 載體與siRNA模板鏈連接 T4連接酶連接模板與載體，模板與載體按照摩爾數(shù)比約為4︰1的比例加入，16℃反應過夜。

1.5.4 重組質粒的鑒定 BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pGCsilencer-U6-siRNA-Neu3質粒（以下簡稱“pGCsi-Neu3”）。酶切后產(chǎn)物電泳結果顯示有小片段者初步預測可能為陽性重組質粒。懷疑為陽性克隆的重組質粒委托上海生物工程技術服務有限公司進行cDNA序列測定鑒定。

1.5.5 熒光顯微鏡檢測PC-3細胞轉染pGCsi-Neu3質粒的轉染效率 pGCsi-Neu3質粒攜帶GFP基因，當質粒轉染PC-3細胞后可表達綠色熒光蛋白，為保證后續(xù)實驗的可靠性，首選需要確定細胞的轉染效率不低于50%。轉染效率=發(fā)綠色熒光的細胞數(shù)/可見光下細胞數(shù)×100%。該實驗重復3次。

1.6 細胞增殖實驗

細胞生長融合度達90%時，進行瞬時轉染，只加入轉染試劑的命名為空白對照組（Mock組），轉染pGCsi-Scramble質粒的命名為pGCsi-Scramble組，轉染3個不同位點的pGCsi-Neu3質粒的分別命名為pGCsi-Neu3-1組、pGCsi-Neu3-2組、pGCsi-Neu3-3組，后續(xù)實驗參照此分組命名。用PBS將MTT配置為終濃度為5 mg/mL的工作液，細胞瞬時轉染后分別在24、48、72 h檢測細胞數(shù)目，檢測時每孔加入含有10 μL MTT工作液的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，去除上清，每孔加入100 μL的DMSO，震蕩混勻后檢測A490吸光度值。該實驗重復3次。

1.7流式細胞術

收集轉染后48 h的PC-3細胞，預冷PBS洗滌細胞3次后，參照Abcom公司Annexin V-FIFC試劑盒說明書進行實驗操作，流式細胞術分析細胞凋亡。該實驗重復3次。

1.8 Transwell檢測pGCsi-Neu3質粒對細胞遷移、侵襲的影響

Transwell細胞遷移實驗[20]按照ECM550系列遷移實驗操作說明，將200 μL含有5×104個細胞的IMDM無血清培養(yǎng)基混懸液加入Transwell上室，下室加入600 μL含有10%FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，多聚甲醛固定，結晶紫染色，于倒置顯微鏡選取3個視野拍照記錄，選用濃度為33%醋酸進行結晶紫脫色，洗脫液混勻后在酶標儀上595 nm測其OD值，間接反映細胞數(shù)。該實驗重復3次。Transwell細胞侵襲實驗[20]：上室加入40 μL的1︰7無血清培養(yǎng)基稀釋的Matrigel膠，37℃細胞培養(yǎng)箱過夜，于次日進行遷移實驗。其固定、染色、拍照、洗脫等實驗步驟參照Transwell遷移實驗。該實驗重復3次。

1.9統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用F檢驗，兩組間比較采用q檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 pGCsi-Neu3質粒構建及測序結果

原始質粒及酶切后電泳結果見圖1A，根據(jù)不同靶點構建的3個pGCsi-Neu3質粒進行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切鑒定，均有小片段被切下，見圖1B，酶切鑒定成功后，進行DNA測序鑒定，測序結果與連入siRNA模板鏈序列完全一致，見圖1C。

2.2 pGCsi-Neu3質粒轉染結果及熒光顯微鏡檢測

PC-3細胞轉染質粒48 h后，在藍色熒光激發(fā)下發(fā)現(xiàn)轉入pGCsi-Neu3-1、pGCsi-Neu3-2、pGCsi-Neu3-3質粒的PC-3細胞發(fā)出綠色熒光。轉染效率超過70%，可以保證后續(xù)實驗數(shù)據(jù)的可信性。見圖2（封底）。

2.3 pGCsi-Neu3質粒沉默效率

轉染48 h后，Mock組、pGCsi-Scramble組、pGCsi-Neu3-1組、pGCsi-Neu3-2組、pGCsi-Neu3-3組PC-3細胞中Neu3相對表達量分別為：0.752±0.029、0.741±0.019、0.493±0.033、0.427±0.024、0.219±0.023。pGCsi-Neu3-3組PC-3細胞中Neu3相對表達量明顯低于對照組（Mock組、pGCsi-Scramble組），差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。

2.4 pGCsi-Neu3質粒對PC-3細胞增殖、凋亡的影響

PC-3細胞轉染重組質粒后，采用MTT法監(jiān)測在24、48、72 h等時間點細胞的生長。在48、72 h時，pGCsi-Neu3-1組、pGCsi-Neu3-2組和pGCsi-Neu3-3組與Mock組、pGCsi-Scramble組比較，可有效抑制細胞增殖，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01），其中pGCsi-Neu3-3組抑制效果最為明顯。根據(jù)MTT實驗結果，收集轉染后48 h的各組細胞，PI和Annexin V雙重染色后通過流式細胞術檢測凋亡發(fā)現(xiàn)，pGCsi-Neu3-3組與Mock組比較細胞凋亡明顯，凋亡率為18.1%，見圖3B。免疫組織化學法檢測PCNA的表達，結果發(fā)現(xiàn)pGCsi-Neu3-3組與對照組比較，細胞核中少見棕黃色顆粒。見圖3A。

2.5 pGCsi-Neu3質粒抑制細胞遷移和侵襲

PC-3細胞轉染質粒后，利用Transwell實驗檢測PC-3細胞轉移、侵襲能力的改變。結果發(fā)現(xiàn)pGCsi-Neu3-3組，無論是遷移實驗還是侵襲實驗，其細胞數(shù)目與Mock組比較，均有所下降，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖4（封底）。

3 討論

Neu3是唾液酸酶家族重要的一員，廣泛表達于人體各種組織中，參與多種生理活動。Neu3表達增高對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮重要影響。本研究構建針對Neu3基因siRNA表達質粒，并對其進行鑒定和篩選后，在體外檢測降低Neu3表達對前列腺癌的生長、轉移的作用及機制。

本研究根據(jù)Neu3基因信息，使用在線siRNA序列設計軟件，設計了3條針對目的基因編碼序列區(qū)的siRNA序列，測序鑒定質粒構建成功。為保證實驗數(shù)據(jù)的可信性，首先進行了轉染效率的測定，結果發(fā)現(xiàn)利用脂質體進行轉染，PC-3細胞轉染效率可以超過70%，可以保證后續(xù)實驗需求。Neu3 mRNA檢測發(fā)現(xiàn)3號Neu3 siRNA抑制目的基因效率最高，MTT實驗結果顯示3號Neu3 siRNA抑制細胞增殖效果最為明顯，根據(jù)上述兩個實驗結果因此后續(xù)實驗均選擇3號pGCsi-Neu3-3質粒進行。流式細胞術結果顯示pGCsi-Neu3-3質粒促進PC-3細胞凋亡，凋亡率可達18.1%。細胞增殖相關基因（PCNA）在細胞增殖的啟動上起重要作用，是反映細胞增殖狀態(tài)的良好指標[21]。pGCsi-Neu3-3組細胞核棕黃色顆粒明顯減少，表明細胞增殖能力明顯下降。Transwell實驗結果顯示pGCsi-Neu3-3組細胞數(shù)目減少，說明細胞遷移、侵襲能力下降。降低Neu3表達可抑制細胞增殖、遷移、侵襲，促進細胞凋亡，為今后前列腺癌靶向治療提供一個新的參考治療靶點。

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（收稿日期：2018-01-02 本文編輯：任 念）