田麗莉，朱國(guó)福，盛東來(lái)

（1.浙江醫(yī)院 中藥房，浙江 杭州 310013；2.上海中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，上海 201203；3.杭州師范大學(xué) 發(fā)育與再生研究所，浙江 杭州 310036）

冬凌草[Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara]，唇形科香茶菜屬植物，主要分布于中國(guó)黃河流域和黃河流域以南的區(qū)域，具有清熱解毒、健胃活血、消炎止痛及抗腫瘤等功效。冬凌草甲素為冬凌草抗腫瘤的主要活性成分[1]。本課題組前期研究證明，冬凌草甲素可明顯抑制斑馬魚(yú)血管生成[2]。但冬凌草甲素在血管內(nèi)皮細(xì)胞方面的研究較少，本研究選擇人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC），研究冬凌草甲素對(duì)HUVEC增殖、凋亡、遷移、侵襲和成管的影響，為血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料 冬凌草甲素（Oridonin，上海源葉生物科技有限公司），經(jīng)高效液相色譜鑒定，純度≥98%；HUVEC（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；RPMI1640培養(yǎng)液（美國(guó)Invitrogen公司），MTT試劑盒（美國(guó)Sigma公司），Annexin V-FITC試劑盒（美國(guó)BD Pharmingen公司），Matrigel試劑盒（美國(guó)BD Pharmingen公司），Calcein-AM試劑盒（美國(guó)Sigma公司），結(jié)晶紫染色液（上海碧云天生物科技有限公司），二甲基亞砜（上海展云化工有限公司）；Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；RT試劑盒（大連Takara公司），DRR041A SYBR試劑盒（大連Takara公司），引物由大連TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力：培養(yǎng)HUVEC，培養(yǎng)的具體條件為：RPMI1640（含10%胎牛血清、100 U青霉素和100 U鏈霉素），于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為6×104個(gè)/mL，96孔板中每孔加入90 μL細(xì)胞懸液；次日，每孔加入10 μL低、中、高濃度的冬凌草甲素（濃度分別為156、312、625 mg/L），并于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；此后在24 h時(shí)檢測(cè)，每孔加入5 g/L的MTT 10 μL，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；4 h后，將上清吸出，加入DMSO，于570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值（OD570）。

1.2.2 流式細(xì)胞熒光分選法（FACS）檢測(cè)細(xì)胞凋亡：培養(yǎng)HUVEC，培養(yǎng)的具體條件為：RPMI1640（含10%胎牛血清、100 U青霉素和100 U鏈霉素），于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，至細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)/mL，6孔板中每孔鋪2 mL細(xì)胞懸液；次日，加入低、中、高濃度的冬凌草甲素（濃度分別為39、156、625 mg/L）；24 h后，消化細(xì)胞；收集懸浮細(xì)胞：離心5 min；貼壁細(xì)胞：用不含EDTA的胰酶消化收集后，于室溫2 000 r/min離心6 min，收集細(xì)胞；細(xì)胞洗滌：用預(yù)冷1×PBS（4 ℃）重懸細(xì)胞1次，2 000 r/min離心6 min，洗滌細(xì)胞；加入300 μL的1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞；Annexin V-FITC標(biāo)記：加入5 μL的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min；PI標(biāo)記：上機(jī)前5 min再加入5 μL的PI染色；上機(jī)前，補(bǔ)加100 μL的1×Binding Buffer，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 穿透小室法（Transwell）檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲：細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：HUVEC撤去血清，培養(yǎng)過(guò)夜；次日，消化細(xì)胞，用PBS洗2次；用含0.1% BSA的無(wú)血清培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105個(gè)/mL；取細(xì)胞懸液200 μL加入24孔板配套小室中，下室加入500 μL含10% FBS的培養(yǎng)液或低、中、高濃度的冬凌草甲素（濃度分別為39、78、156 mg/L），盡量避免氣泡產(chǎn)生，于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；用棉簽擦去小室底部多聚碳酸脂膜上未穿膜的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色；顯微鏡鏡下觀察并拍照；33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫洗滌收集，測(cè)OD570。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建Transwell小室，底部均勻包被50 μL matrigel，超凈臺(tái)風(fēng)干過(guò)夜；次日，每孔加入2% BSA 50 μL，37 ℃烘2 h，PBS沖洗2遍；HUVEC消化后PBS洗2次，用含0.1% BSA的無(wú)血清培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105個(gè)/mL；取細(xì)胞懸液200 μL加入24孔板配套小室中，下室加入500 μL含10% FBS的培養(yǎng)液或低、中、高濃度的冬凌草甲素（濃度分別為39、78、156 mg/L），盡量避免有氣泡，于37 ℃培養(yǎng)24 h；棉簽擦去小室底部多聚碳酸脂膜上未穿膜的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡鏡下觀察并拍照；33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫洗滌收集，測(cè)OD570。

1.2.4 管腔形成實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)血管生成：培養(yǎng)HUVEC，培養(yǎng)的具體條件為：RPMI1640（含10%胎牛血清、100 U青霉素和100 U鏈霉素），于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；鋪6孔板，加入低、中、高濃度的冬凌草甲素（濃度分別為25、100、400 mg/L）培養(yǎng)24 h；次日，實(shí)驗(yàn)前用預(yù)冷的Matrigel包被15孔板，每孔10 μL，于37 ℃培養(yǎng)箱放置1 h；將HUVEC計(jì)數(shù)后種入Matrigel包被的小孔中，每孔約1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h以形成網(wǎng)狀血管結(jié)構(gòu)；用10 μmol/L Calcein-AM染料避光染色30 min，置熒光顯微鏡下觀察并拍照，利用imagepro plus計(jì)數(shù)以比較結(jié)果。

1.2.5 相對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)VEGFA和VEGFR2基因的表達(dá)量：樣本來(lái)源為1.2.1中各實(shí)驗(yàn)組中的HUVEC，加1 mL Trizol研磨均勻，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，室溫靜置5 min；加入0.2 mL氯仿，震搖15 s，室溫靜置3 min，離心15 min（4 ℃，12 000 r/min）；取上層水相0.4 mL，加入等量異丙醇，室溫靜置10 min，離心10 min（4 ℃，12 000 r/min）；棄去上清液，加75%預(yù)冷乙醇，渦旋，離心5 min（4 ℃，7 500 r/min）；棄去上清液，晾干沉淀，加DEPC水20 μL溶解。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定并計(jì)數(shù)得濃度，并用1%瓊脂糖凝聚電泳輔助檢測(cè)。cDNA的合成：取上述合格的RNA樣品，根據(jù)濃度計(jì)算體積配比用量使各取樣量均為0.5 μg，按照RT試劑盒和DRR041 SYBR熒光定量試劑盒的說(shuō)明書(shū)具體操作，選用ABI PCR儀，并用相應(yīng)軟件設(shè)置反應(yīng)程序和進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以 ±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素抑制HUVEC增殖 通過(guò)MTT法檢測(cè)HUVEC的活力，結(jié)果顯示冬凌草甲具有抑制HUVEC增殖的作用，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，選擇在24 h時(shí)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活性，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，冬凌草甲素具有明顯的抑制HUVEC增殖的作用，且在低濃度到高濃度的實(shí)驗(yàn)組范圍內(nèi)，具有濃度依賴性，冬凌草甲素的濃度越高，其抑制作用越強(qiáng)（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。見(jiàn)圖5。

圖1 冬凌草甲素抑制HUVEC的增殖作用

圖2 冬凌草甲素誘導(dǎo)HUVEC的晚期凋亡作用

圖3 冬凌草甲素誘導(dǎo)HUVEC的早期凋亡作用

2.2 冬凌草甲素誘導(dǎo)HUVEC凋亡 通過(guò)FACS法檢測(cè)HUVEC的凋亡，結(jié)果顯示：冬凌草甲素具有明顯誘導(dǎo)HUVEC凋亡的作用（P＜0.01），并且HUVEC的凋亡期主要表現(xiàn)為晚期凋亡細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞。且在低濃度到高濃度的實(shí)驗(yàn)組范圍內(nèi)，具有濃度依賴性，隨著冬凌草甲素的濃度升高，其誘導(dǎo)HUVEC凋亡的效果越強(qiáng)。見(jiàn)圖2-3。

2.3 冬凌草甲素抑制HUVEC遷移 通過(guò)Transwell法檢測(cè)HUVEC的遷移，結(jié)果顯示：冬凌草甲素具有明顯抑制HUVEC遷移的活性（P＜0.05），且在低濃度到高濃度的實(shí)驗(yàn)組范圍內(nèi)，具有濃度依賴性，隨著冬凌草甲素的濃度升高，抑制效果增強(qiáng)。見(jiàn)圖4。

2.4 冬凌草甲素抑制HUVEC侵襲 通過(guò)Transwell法檢測(cè)HUVEC的侵襲，結(jié)果顯示：冬凌草甲素具有明顯的抑制HUVEC侵襲的活性，與空白對(duì)照組比較，高濃度組的冬凌草甲素抑制效果顯著（P＜0.01）。

圖4 冬凌草甲素抑制HUVEC的遷移作用

2.5 冬凌草甲素抑制HUVEC成管 通過(guò)管腔形成實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)HUVEC的血管生成，結(jié)果顯示：100、400 mg/L的冬凌草甲素具有明顯抑制HUVEC的管腔形成作用（P＜0.01），且在低濃度到高濃度的實(shí)驗(yàn)組范圍內(nèi)，隨著冬凌草甲素的濃度升高，其抑制管腔形成的效果越強(qiáng)。見(jiàn)圖6。

2.6 冬凌草甲素降低HUVEC中VEGFA和VEGFR2基因的表達(dá)量 相對(duì)熒光定量PCR結(jié)果顯示：冬凌草甲素可降低VEGFA和VEGFR2基因的表達(dá)量（P＜0.05），且在低濃度到高濃度的實(shí)驗(yàn)組范圍內(nèi)，隨著冬凌草甲素的濃度升高，VEGFA和VEGFR2基因的表達(dá)量逐漸降低。見(jiàn)圖7。

圖5 冬凌草甲素抑制HUVEC的侵襲作用

圖6 冬凌草甲素抑制HUVEC管腔形成的作用

圖7 冬凌草甲素抑制HUVEC中VEGFA和VEGFR2基因的表達(dá)

3 討論

研究表明冬凌草甲素具有很好的抗腫瘤作用，其機(jī)制主要是抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，與治療藥物的協(xié)同作用等[1]。但是，冬凌草甲素是否具有抑制血管生成作用，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道很少。

目前，抑制血管生成藥物的篩選模型主要有血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、移行、成管分析、雞胚血管生成、大鼠動(dòng)脈環(huán)微血管模型等，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞是比較經(jīng)典的體外研究模型[3]。血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)常選用的細(xì)胞類(lèi)型為HUVEC，因其具有干細(xì)胞的潛能，理論上可以傳代50～60次；內(nèi)皮細(xì)胞直接接觸血液，在血管形成的生理或病理過(guò)程中作用重大[4]。因此，本研究選擇HUVEC模型，并且證明冬凌草甲素具有明顯誘導(dǎo)HUVEC凋亡，抑制HUVEC增殖、遷移和侵襲，以及抑制HUVEC的管腔形成的作用。

VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)及分化的首要因子，在血管生成過(guò)程中具有關(guān)鍵的作用，VEGFR通過(guò)胞外區(qū)與VEGF結(jié)合，形成同源二聚體，從而激活細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶，因此VEGF-VEGFR信號(hào)通路為抗血管生成機(jī)制方面研究的主要方向之一[5]。VEGF家族成員主要有VEGFA、VEGFB、VEGFC等，其中VEGFA是最主要的促血管生成因子，在生理性或病理性血管調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用[6]；VEGFR2是首要調(diào)節(jié)血管生成活性的受體，VEGFR2可與VEGFA、VEGFC、VEGFD相結(jié)合，通過(guò)VEGF通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的生成、遷移、分化及成管[7]；沉默VEGFR2可明顯抑制血管生成活性[8]。本研究證明，冬凌草甲素可降低HUVEC中VEGFA和VEGFR2基因的表達(dá)量，這可能與冬凌草甲素抑制HUVEC的活性有關(guān)。與前期研究結(jié)果[2]相一致。

冬凌草甲素抑制血管生成方面的活性可能與c-Met、Notch信號(hào)通路有關(guān)[9-10]。調(diào)節(jié)血管生成的重要信號(hào)通路是VEGF-VEGFR、Ang-Tie2和Dll4-Notch信號(hào)通路，它們各自作用又相互影響，從而共同促進(jìn)、協(xié)調(diào)血管生成[11]。研究表明：VEGF-VEGFR信號(hào)通路是抗腫瘤轉(zhuǎn)移的主要治療方向[5，12]。但冬凌草甲素抑制血管生成活性方面整體模型上的作用機(jī)制仍有待深入研究?！吨嗅t(yī)藥健康服務(wù)發(fā)展規(guī)劃（2015—2020年）》中指出：“中醫(yī)藥是我國(guó)獨(dú)具特色的健康服務(wù)資源”。中醫(yī)藥兼顧整體觀和個(gè)體化，療效緩和而持久，不良反應(yīng)相對(duì)較小，受到研究者的青睞，在堅(jiān)持中醫(yī)藥基本理論的前提下，從中藥中篩選和開(kāi)發(fā)具有血管抑制活性的抗腫瘤藥物潛力很大[13-14]。

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