陳秀芳，雷康福，董敏，鄭巧敏

（溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035，1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室；2.生物學(xué)實驗教學(xué)中心）

我國糖尿病的患病率高達9.7%，其中90%以上為2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）[1]。糖尿病不斷進展的本質(zhì)是胰島素分泌功能的持續(xù)減退，初發(fā)患者診斷為糖尿病時β細胞功能已降低50%[2]。與正常人群相比，T2DM患者胰島β細胞數(shù)目明顯減少，凋亡明顯增加[3]。因此保護胰島β細胞功能，抑制其凋亡成為預(yù)防和治療T2DM的重要措施。葛根素（puerarin，Pue）是從傳統(tǒng)中藥葛根中提取的異黃酮化合物，被證實有降低血糖、保護心肌等作用[4-7]。本研究采用高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）腹腔注射建立T2DM大鼠模型，觀察胰腺組織氧化應(yīng)激指標、端粒長度、沉默信息調(diào)節(jié)因子1（sirtuin 1，SIRT1）、解偶聯(lián)蛋白2（uncoupling protein 2，UCP2）及凋亡相關(guān)蛋白的表達變化，探討葛根素對胰腺β細胞的保護作用及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量160～180 g，購自浙江省實驗動物中心，許可證號：SCXK（浙）2008-0033。

1.1.2 飼料：高脂飼料（60%脂肪，D12492）、普通飼料（10%脂肪，D12450J）購自美國Research Diets公司。

1.1.3 主要藥物和試劑：STZ由美國Sigma公司提供；葛根素注射液（批號130902）由廣州白云山天心制藥股份有限公司提供；血糖測試紙、定量PCR試劑盒購自瑞士Roche公司；糖化血紅蛋白（HbA1c）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；胰島素ELISA試劑盒購自瑞典Mercodia公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒，RIPA裂解液由上海碧云天生物技術(shù)研究所提供；蛋白酶/磷酸酶抑制劑、BCA蛋白含量檢測試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司；相關(guān)抗體包括caspase-3、cleaved caspase-3（Asp175）、Bim、Bax、Bcl-2、SIRT1、腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、p-AMPK（Thr172）、UCP2、β-actin購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型復(fù)制、分組及給藥：大鼠常規(guī)飼料喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組（NC組，8只）和造模組（22只）。NC組大鼠在整個實驗周期中喂以普通飼料，造模組大鼠在整個實驗周期中喂以高脂飼料。5周后，造模組大鼠在禁食12 h后一次性腹腔注射STZ 35 mg·kg-1（STZ臨用前用0.1 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液配成2%、pH 4.2的溶液），NC組大鼠腹腔注射等體積枸櫞酸鈉緩沖液。72 h后取尾血測血糖，血糖≥16.7 mmol/L表示T2DM胰島素抵抗大鼠模型復(fù)制成功。將成模大鼠隨機分為糖尿病模型（DM）組和葛根素治療（DM+Pue）組，DM+Pue組腹腔注射葛根素（100 mg·kg-1），DM組及NC組大鼠腹腔注射等體積賦形劑（5%丙二醇）。各組大鼠每天在規(guī)定時間內(nèi)用藥，每天1次，連續(xù)4周。

1.2.2 樣品收集：末次給藥1 d后，用2%戊巴比妥鈉溶液（30 mg·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采血處死動物。留取血液，在4 ℃靜置4 h后，4 ℃1 500 r/min離心15 min分離血清備用。迅速分離胰腺組織，置液氮速凍后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 生化指標檢測：血糖濃度采用快速血糖儀測定，HbA1c用比色分析法、胰島素含量用ELISA法、SOD活性用WST-8法、CAT活性用過氧化物酶法、MDA含量用硫代巴比妥酸法、蛋白質(zhì)含量用BCA法測定，均按試劑盒說明書操作。

1.2.4 胰腺組織端粒長度測定：采用基因組提取試劑盒提取胰腺組織DNA，NanoDrop 2000檢測DNA的純度和濃度。用端粒長度比值，即樣本中端粒重復(fù)拷貝數(shù)和單拷貝基因拷貝數(shù)的比值來評估端粒長度，應(yīng)用real-time PCR技術(shù)檢測[8]。端粒（Telomere）基因的上游引物序列為5’-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTT TGGGTTTGGGTTTGGGTT-3’，下游引物序列為5’-GGCTTGC CTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3’；內(nèi)參照基因（36b4）上游引物序列為5’-ACTGGTCTAGGACCCGAG AG-3’，下游引物序列為5’-TCAATGGTGCCTCTGGAGAT T-3’；上述引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系總體積20 μL，其中2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL（濃度為10 μmoL/L），模板DNA 2 μL（濃度為7.5 ng/μL），超純水6 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃15 s，62 ℃ 1 min，共40個循環(huán)；首循環(huán)95 ℃5 min，擴增反應(yīng)的特異性用熔解曲線檢驗。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達：用RIPA裂解液提取大鼠胰腺組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度。經(jīng)10% SDS-PAGE分離，PVDF膜印跡，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h后，加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST震搖洗滌10 min×3次；用封閉液稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下?lián)u床孵育1 h，再次TBST震搖洗滌10 min×3次；用ECL試劑盒顯色，凝膠成像儀拍照，Image J軟件分析條帶灰度值，確定樣品中目的蛋白相對含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件進行分析。數(shù)據(jù)用 ±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間行LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 葛根素對T2DM大鼠空腹血糖、HbA1c、血清胰島素含量的影響 與NC組比較，DM組大鼠空腹血糖、HbA1c含量明顯升高（均P＜0.01），血清胰島素水平顯著降低（P＜0.01）；與DM組比，DM+Pue組大鼠血糖、HbA1c含量顯著降低（均P＜0.01），胰島素含量明顯升高（P＜0.01），見圖1。

圖1 各組大鼠空腹血糖、HbA1c和血清胰島素含量比較（n=8）

2.2 葛根素對T2DM大鼠胰腺組織氧化應(yīng)激的影響 DM組大鼠胰腺組織SOD、CAT活性明顯低于NC組（均P＜0.01），MDA含量明顯高于NC組（P＜0.01）；予以葛根素干預(yù)后，SOD、CAT活性顯著升高（均P＜0.01），而MDA含量顯著降低（P＜0.01），見圖2。

圖2 各組大鼠胰腺組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標比較（n=8）

2.3 葛根素對T2DM大鼠胰腺組織端粒長度的影響 與NC組相比，DM組大鼠胰腺組織端粒長度明顯縮短（P＜0.01），給予葛根素干預(yù)后，端粒長度顯著增加（P＜0.01），見圖3。

2.4 葛根素對T2DM大鼠胰腺組織凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 與NC組比較，DM組大鼠胰腺組織中促凋亡蛋白Bax、Bim和cleaved caspase 3/caspase 3的表達明顯增加（均P＜0.01），而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達顯著降低（P＜0.01）；DM+Pue組Bax、Bim、cleaved caspase 3/caspase 3表達顯著降低（均P＜0.01），Bcl-2表達明顯增加（P＜0.01），見圖4。

圖3 各組大鼠胰腺組織端粒長度變化（n=6）

2.5 葛根素對T2DM大鼠胰腺組織UCP2、SIRT1、p-AMPK/AMPK蛋白表達的影響 如圖5所示，與NC組比較，DM組大鼠胰腺組織中UCP2表達明顯增加（P＜0.01），p-AMPK/AMPK、SIRT1表達顯著降低（均P＜0.01）；葛根素顯著下調(diào)UCP2表達（P＜0.01），上調(diào)p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白表達（均P＜0.01）。

圖4 各組大鼠胰腺組織凋亡相關(guān)蛋白表達水平比較（n=4）

圖5 各組大鼠胰腺組織UCP2、SIRT1和p-AMPK/AMPK蛋白表達水平比較（n=4）

3 討論

研究表明，糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[9]。胰島是人體中抗氧化能力較弱的器官，對活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）含量的變化尤為敏感，容易受氧化應(yīng)激攻擊而損傷[9]。糖尿病長期高糖狀態(tài)導(dǎo)致胰腺組織中抗氧化酶SOD、CAT活性降低，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量增加，提示ROS生成增多，氧化應(yīng)激增強。而ROS上調(diào)線粒體內(nèi)膜解偶聯(lián)蛋白UCP2的表達[10]，使線粒體氧化和磷酸化過程脫離，ATP生成減少，導(dǎo)致胰腺β細胞分泌胰島素減少，血糖進一步升高，形成惡性循環(huán)。糖尿病大鼠予以葛根素干預(yù)后，胰腺組織SOD、CAT活性增加，ROS生成減少，UCP2表達降低，胰島素分泌增加而血糖和HbA1c含量降低。有研究[11]報道，UCP2負性調(diào)節(jié)胰島素分泌，UCP2基因敲除的小鼠胰島，避免了高糖誘導(dǎo)的損傷。

端粒長度是β細胞功能和糖尿病發(fā)病機制的一個決定因素[12]。在一項納入了9項研究（包括5 759例患者和6 518例對照）的關(guān)于T2DM的Meta分析中指出，端粒長度的縮短與T2DM的發(fā)病風(fēng)險密切相關(guān)[13]。1型和2型糖尿病患者均有端粒的縮短，且與氧化應(yīng)激程度呈正相關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠胰腺組織端粒長度明顯縮短，可能與胰腺中增多的ROS誘導(dǎo)端粒酶從細胞核向線粒體轉(zhuǎn)位[15]，使端粒酶修復(fù)端粒的功能喪失有關(guān)。而端?？s短會導(dǎo)致胰島β細胞復(fù)制能力降低，當端?？s短到一定程度，細胞停止分裂并啟動凋亡。而且，高濃度ROS導(dǎo)致凋亡相關(guān)基因的表達失調(diào)，抗凋亡基因Bcl-2表達減少，促凋亡基因Bax、Bim表達增加，加速細胞凋亡連鎖反應(yīng)，引起caspase級聯(lián)激活，誘發(fā)細胞凋亡[16]。葛根素顯著抑制糖尿病大鼠胰島β細胞端粒長度的縮短，同時抑制促凋亡蛋白的表達，保護β細胞功能，與文獻[17-18]報道一致。

SIRT1是哺乳動物中第一個被發(fā)現(xiàn)的Sirtuin蛋白家族成員，作為NAD+依賴的蛋白去乙酰化酶，在胰腺、肝臟、骨骼肌等與能量代謝密切相關(guān)的組織中參與調(diào)節(jié)糖脂穩(wěn)態(tài)[19]。SIRT1可以通過減緩胰腺β細胞衰老和抑制凋亡保護β細胞功能[19]。SIRT1缺失，葡萄糖刺激的胰島素分泌受到抑制[20]。AMPK可通過增加細胞內(nèi)NAD+水平來增強SIRT1的活性[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠胰腺組織中AMPK磷酸化減少，SIRT1表達降低；葛根素明顯上調(diào)SIRT1的表達，增加AMPK磷酸化水平，使細胞內(nèi)NAD+含量增加，SIRT1活性增強。而SIRT1可通過與UCP2基因啟動子區(qū)結(jié)合，抑制UCP2基因的表達[22]。胰腺β細胞過表達SIRT1的轉(zhuǎn)基因小鼠，UCP2表達減少，胰島素分泌增加[23]。本研究予以糖尿病大鼠葛根素治療后血清胰島素含量增加，也可能與其增強SIRT1活性進而減少UCP2表達有關(guān)。

綜上所述，本研究表明葛根素對T2DM大鼠胰腺β細胞具有一定的保護作用，其機制可能一方面與減輕氧化應(yīng)激損傷，保護端粒長度進而抑制β細胞凋亡有關(guān)，另一方面與增強SIRT1活性，減少UCP2表達有關(guān)。

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