黃 貞

(廣西百色市人民醫(yī)院產(chǎn)科，廣西 百色 533000)

我國為全球新生兒出生缺陷的高發(fā)國家，每年新發(fā)先天畸形兒可占到總出生人口數(shù)的4%～6%，其中又以21-三體綜合征(唐氏綜合征，DS)、18-三體綜合征(愛德華氏綜合征，ES)及神經(jīng)管缺陷(NTD)等較為多見[1]，患兒出生后多伴有不同程度神經(jīng)或結(jié)構(gòu)畸形，嚴(yán)重影響人口素質(zhì)及帶給給社會(huì)和家庭嚴(yán)重負(fù)擔(dān)，由目前于缺乏有效治療手段，因此通過產(chǎn)前篩查和診斷預(yù)防此類新生兒具有積極的意義。介入性產(chǎn)前診斷是染色體異常檢測金標(biāo)準(zhǔn)，但其有創(chuàng)性操作具有一定潛在風(fēng)險(xiǎn)，而血清學(xué)生化指標(biāo)篩查假陽性率較高、敏感性較低。近年來妊娠母體外周血中發(fā)現(xiàn)游離胎兒DNA為無創(chuàng)產(chǎn)前篩查和診斷提供了新途徑[2]。本文通過對(duì)孕婦外周血中胎兒游離DNA進(jìn)行檢測，來評(píng)估無創(chuàng)DNA篩查的可行性與準(zhǔn)確性，并對(duì)妊娠結(jié)局進(jìn)行隨訪。

1 資料與方法

1.1一般資料：選擇2013年1月～2016年9月在我院產(chǎn)前門診自愿接受無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測的1 036例孕婦為研究對(duì)象，孕周為10～21+6周，年齡19～45歲，平均(33.61±4.53)歲。接受無創(chuàng)DNA檢測的孕婦情況主要包括以下個(gè)類型：①單純高齡(≥35歲)；②唐氏綜合征篩查提示高風(fēng)險(xiǎn)，即21-三體風(fēng)險(xiǎn)值≥1/270、18-三體風(fēng)險(xiǎn)值≥1/350；③產(chǎn)前超聲檢查提示異常，如胎兒頸項(xiàng)透明層厚度(NT值)異常、胎兒結(jié)構(gòu)異常；④既往有不良生育史；⑤自愿直接行DNA檢測。接受無創(chuàng)DNA的孕婦情況：唐篩異常356例(34.36%)，高齡527例(50.87%)，自愿直接DNA檢測92例(8.88%)，超聲檢查異常39例(3.76%)，既往不良孕產(chǎn)史22例(2.12%)。

1.2方法：DNA檢測方法：抽取孕婦靜脈外周血10 ml，孕婦無需空腹，樣本置于EDTA抗凝管中，在44℃條件下經(jīng)二次離心分離血漿，將提取所得血漿樣本置于-80℃冰箱中能保存待測。血漿樣本嚴(yán)格按照試劑盒說明書提取DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增構(gòu)建測序的DNA文庫，之后采用I2-ples高通量hiseq 2000測序儀進(jìn)行測序，將所測得序列與人類基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比分析，計(jì)算每條染色體序列數(shù)目比率。通過公式計(jì)算樣本染色體的標(biāo)準(zhǔn)化Z值，如Z值≥3，則認(rèn)為待測樣本為三體高危，反之如Z值<3，則為三體低危。對(duì)于提示為高危孕婦者則動(dòng)員其進(jìn)行羊水穿刺取樣對(duì)染色體核型分析確診。

羊水染色體核型分析：對(duì)于DNA檢測提示高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，在B超引導(dǎo)下型羊膜腔穿刺，抽取羊水樣本進(jìn)行離心，取沉淀物在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)合適天數(shù)后，經(jīng)處理后得到羊水細(xì)胞標(biāo)本片，進(jìn)行染色體核型分析。

2 結(jié)果

2.1無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果：1 036例標(biāo)本中共檢出21、18、13-三體綜合征29例，占2.79%，以21-三體綜合征最為多見。具體見表1。

表1無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果(例)

情況例數(shù)21三體18三體13三體性染色體異常合計(jì)唐篩異常356820010高齡52762109自愿直接DNA檢測9220103超聲檢查異常3911002既往不良孕產(chǎn)史2222105合計(jì)10361973029

2.2無創(chuàng)DNA檢測與羊水細(xì)胞核型分析結(jié)果對(duì)比：羊水細(xì)胞核型分析結(jié)果對(duì)比，21-三體綜合征、18-三體綜合征和13-三體綜合征無創(chuàng)DNA檢測符合率分別為10例(100%)、8例(88.89%)和3例(100%)。

2.3妊娠結(jié)局：確診的10例21-三體者中，自然流產(chǎn)2例，引產(chǎn)8例，無明顯原因死胎0例，出現(xiàn)不良妊娠結(jié)局者0例；8例18-三體者中，自然流產(chǎn)2例，引產(chǎn)3例，無明顯原因死胎2例，出現(xiàn)不良妊娠結(jié)局者1例；3例13-三體者中，自然流產(chǎn)0例，引產(chǎn)2例，無明顯原因死胎1例，出現(xiàn)不良妊娠結(jié)局者0例。

3 討論

傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方法如羊水穿刺、絨毛穿刺等仍是目前產(chǎn)前診斷金標(biāo)準(zhǔn)，雖然能經(jīng)常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)和染色體核型分析獲得準(zhǔn)確結(jié)果，且覆蓋面較廣，但均為侵入性有創(chuàng)操作，其細(xì)胞培養(yǎng)需要較長周期才能獲得最終報(bào)告，且具有較大的感染、出血甚至流產(chǎn)等風(fēng)險(xiǎn)，尤其是近年來計(jì)劃生育政策放寬及二胎政策的出臺(tái)使得高齡孕婦逐漸增多，有創(chuàng)性操作帶來更大風(fēng)險(xiǎn)，難以得到孕婦及家屬的接受。上世紀(jì)90年代國外研究發(fā)現(xiàn)孕婦血液循環(huán)中存在胎兒游離DNA存在，通過測序技術(shù)測定母血漿細(xì)胞游離胎兒DNA片段可以確定胎兒染色體倍性[3]，進(jìn)一步研究分析顯示孕婦血漿中的胎兒DAN是以高濃度存在，在孕早期、孕晚期可分別占到血漿DNA總量的3.4%、6.2%，而且在孕7周時(shí)孕婦血漿中即可檢測到胎兒DNA片段，隨著孕周的增加DNA片段濃度也會(huì)隨之增高[4]。國內(nèi)研究表明在高風(fēng)險(xiǎn)孕婦孕中期篩查診斷出21-三體8例、18-三體1例及無腦兒1例，隨訪發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)未行產(chǎn)前診斷而出生的唐氏兒1例，染色體數(shù)目異常嵌合體均選擇引產(chǎn)或中止妊娠，認(rèn)為孕中期產(chǎn)前篩查診斷對(duì)減少出缺陷極其關(guān)鍵[5]。

本研究1036例孕中期孕婦經(jīng)無創(chuàng)DNA檢測顯示標(biāo)本中共檢出21/18/13-三體綜合征29例，占2.29%，以21-三體綜合征共10例，最為多見，這在其他研究[6]中也得到體現(xiàn)。進(jìn)一步的分析顯示與羊水細(xì)胞核型分析結(jié)果對(duì)比，21-三體綜合征、18-三體綜合征和13-三體綜合征無創(chuàng)DNA檢測符合率分別為100%、88.89%和100%，與其他研究基本一致。熊敏等[7]報(bào)道5例孕婦血胎兒無創(chuàng)DNA檢測5例提示21三體綜合體者，均經(jīng)羊水和臍血染色體證實(shí)異常，符合率達(dá)100%。章容等[8]報(bào)道對(duì)母血胎兒游離DNA大規(guī)模平行測序提示異常的89例進(jìn)行羊水核型分析對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)21例-三體、18-三體符合率分別為100%(28/28)、87.5%(7/8)。雖然也有研究[9]認(rèn)為傳統(tǒng)侵入性羊水核型分析結(jié)果在檢測陽性率方面要高于無創(chuàng)DNA，但總體來說目前的研究大多數(shù)支持兩種方法診斷符合率較高的結(jié)論。

從我國現(xiàn)狀來看染色體異常仍是導(dǎo)致新生兒出生缺陷的重要原因之一，其中又以21-三體綜合征較為多見，隨著無創(chuàng)DNA檢測技術(shù)提高、信息分析方法優(yōu)化及檢測樣本量的增多，該技術(shù)在胎兒染色體篩查的應(yīng)用逐漸廣泛，診斷準(zhǔn)確性也不斷提高。從孕婦外周血對(duì)胎兒游離DNA進(jìn)行染色體診斷，其結(jié)果不受孕婦孕周、生育年齡影響，不會(huì)對(duì)孕婦或胎兒帶來額外創(chuàng)傷，經(jīng)總結(jié)我們認(rèn)為該技術(shù)適合以下情況：①年齡≥35歲周歲的單純高齡孕婦；②唐氏綜合征篩查提示高風(fēng)險(xiǎn)、產(chǎn)前超聲檢查提示異常，且不愿意選擇傳統(tǒng)侵入性產(chǎn)前診斷檢查者；③既往有不良生育史者；④傳統(tǒng)侵入性產(chǎn)前診斷檢查失敗不愿意再次侵入性操作者；⑤自愿接受無創(chuàng)DNA產(chǎn)前診斷者。

綜上所述，孕中期無創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查在21/18/13-三體綜合征診斷方面與羊水細(xì)胞核型分析結(jié)果的診斷符合率較高，且具有快捷、無創(chuàng)、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)，有望成為一種廣泛普及的非侵入性產(chǎn)前篩查新手段。

[1] 吳清明，周 瑾.出生缺陷產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷研究進(jìn)展[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2011,19(1)：129.

[2] 廖 茜，李 力.胎兒游離DNA用于無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的研究進(jìn)展[J].人民軍醫(yī)，2013,56(9)：1084.

[3] 張有成.母血漿游離胎兒DNA檢測在無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2013,21(5)：1.

[4] 鄭 靜，卓 越，孫大康，等.不同年齡段孕婦無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測結(jié)果對(duì)比分析[J].中國婦幼保健，2015,30(36)：6538.

[5] 胡祝明，劉祥印，陳 爽，等.15486例孕中期篩查孕婦妊娠結(jié)局隨訪結(jié)果分析[J].中國婦幼保健，2014,29(3)：361.

[6] 陸海燕，鄭建麗，楊芳芳，等.孕婦外周血胎兒游離DNA檢測在無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2014,22(10)：78.

[7] 熊 敏，孫 輝，王淑媛.孕婦血胎兒無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測的臨床應(yīng)用探討[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2015,23(4)：46.

[8] 章 容，徐聚春，許歡歡，等.5997例母血胎兒游離DNA無創(chuàng)大規(guī)模平行測序篩查胎兒染色體數(shù)目異常[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,35(16)：1744.

[9] 徐冠英.無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測與傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷在產(chǎn)前診斷中應(yīng)用的比較分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2016,24(2)：74.