田亞萍，王成，鐘錦莎，丁夢(mèng)，葛京平，張春妮

（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院臨床檢驗(yàn)科，江蘇南京210002；3.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院泌尿外科，江蘇南京210002）

腎細(xì)胞癌是常見的成人泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病機(jī)制至今不詳，早期多無癥狀，約30%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后極差[1]。故闡明腎細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找新型的分子治療靶標(biāo)，是提高腎細(xì)胞癌患者生存率和改善預(yù)后的關(guān)鍵。

微小核糖核酸（microRNA，miRNAs）是一類小分子非編碼RNA，可通過與靶信使RNA（messenger RNA，mRNA）3′端非翻譯區(qū)（3′-untranslated region，3′-UTR）完全或部分互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA翻譯抑制或降解，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)[2]。不同的miRNAs通過靶向不同的基因發(fā)揮原癌和抑癌基因作用，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3－4]。已有研究顯示，miR-222-3p在惡性甲狀腺濾泡癌水平升高，可用來區(qū)分良惡性甲狀腺濾泡癌[5]；在膠質(zhì)細(xì)胞瘤中，miR-221/222通過與蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶 μ3′-UTR結(jié)合，下調(diào)該蛋白在膠質(zhì)瘤中表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞的侵襲和遷移[6]；卵巢癌上皮細(xì)胞分泌的miR-222-3p可以促進(jìn)單核細(xì)胞向腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[7]。上述研究提示，miR-222-3p的表達(dá)異常與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在miR-222-3p與腎腫瘤的研究中，已報(bào)道腎透明細(xì)胞癌患者血漿中miR-221/222的表達(dá)水平升高并且與其發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān)，具體機(jī)制尚不清楚[8－9]。

Bim是細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵的凋亡調(diào)節(jié)因子，是一種重要的促凋亡蛋白，研究發(fā)現(xiàn)Bim在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[10－11]。Terasawa等[12]發(fā)現(xiàn)miR-222通過在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)Bim的表達(dá)從而減少PC12細(xì)胞凋亡。然而miR-222-3p是否通過調(diào)節(jié)Bim的表達(dá)參與腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展尚未見報(bào)道。因此本研究主要探討miR-222-3p在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)變化、影響腎細(xì)胞癌的凋亡能力以及可能作用的靶基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本來源 收集15例2013年10月至2017年11月在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院泌尿外科手術(shù)的腎細(xì)胞癌組織標(biāo)本，患者平均年齡（63.47±2.99）歲，其中男10例，女5例，均無吸煙飲酒史。14例病理分型為腎透明細(xì)胞癌，1例為嫌色細(xì)胞癌。按照Furhman分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患者組織標(biāo)本進(jìn)行分級(jí)[13]，其中Ⅰ～Ⅱ級(jí) 5例（33.3%），Ⅲ ～Ⅳ級(jí) 3例（20.0%），不確定7例（46.7%），均為新診治患者，行腎癌根治性切除術(shù)前未進(jìn)行任何輔助治療。手術(shù)切除的腎癌組織留作本課題研究的腫瘤標(biāo)本，同時(shí)在距腫瘤遠(yuǎn)端約3～5 cm處切取正常組織作為對(duì)照。組織樣本取出后用液氮速凍，然后保存于－80℃冰箱。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人源腎癌細(xì)胞株769-P（北京協(xié)和細(xì)胞中心）和人胚腎細(xì)胞293T（上海中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫）分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的 RPMI1640、DMEM培養(yǎng)液，并于37℃濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱（5%CO2）以貼壁形式生長(zhǎng)。

1.1.3 試劑與材料 miR-222-3p檢測(cè)探針（美國(guó)Applied Biosystems公司）；miR-222-3p模擬物（miR-222-3p mimic，序 列 為 5′-AGCUACAUCUGGCUACUGGGU-3′）和陰性對(duì)照寡核苷酸（miR-NC mimic，序列為 5′-UAGUGGAUGGCAGGCACACUCA-3′）由上海吉瑪生物公司合成；Bim mRNA定量檢測(cè)引物（前向引物 5′-CACCAGCACCATAGAAGAA-3′，后向引物 5′-ATAAGGAGCAGGCACAGA-3′）、GAPDH定量檢測(cè)引物（前向引物 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，后 向 引 物 5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′）[14]、熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（p-MIRLuciferase report）由金斯瑞公司合成；RIPA試劑（碧云天公司）；Bim抗體（Cell Signaling公司）；GAPDH、α微管蛋白、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗（Santa Cruz公司）；凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)試劑盒（Promega公司）；Opti-MEM培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液、1640培養(yǎng)液和胎牛血清（Gibco公司）；Trizol試劑、Lipofectamine 2000（美國(guó)Invitrogen公司）；SYBR Green試劑（大連TaKaRa公司）；ECL試劑盒（美國(guó)Pierce公司）。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR檢測(cè)腎組織miR-222-3p的表達(dá)組織總RNA用Trizol試劑提取。miR-222-3p檢測(cè)采用莖環(huán)qRT-PCR法。由于組織中常用內(nèi)參miR-16、U6在癌及癌旁正常組織中表達(dá)均有差異（PmiR-16＜0.01，PU6＜0.01），miR-222-3p的表達(dá)由直接循環(huán)閾值法計(jì)算。

1.2.2 靶基因預(yù)測(cè) 應(yīng)用TargetScan在線工具（http/www.targetscan.org/）尋找 miR-222-3p的可能作用靶基因。

1.2.3 熒光素酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 將293T細(xì)胞按每孔5×104個(gè)接種于48孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度為70%時(shí)，分別將 miR-NC mimic、miR-222-3p mimic、Bim野生型、Bim突變型、半乳糖苷酶表達(dá)載體（βgal）質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)6 h后換成含2%胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶的活性。β-gal為內(nèi)參比較實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組熒光素酶活性的變化。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)組織Bim蛋白的表達(dá) 采用 EnVision（DAKO公司）二步法[15]，抗體為Bim（1∶1 000）。使用 ImageJ-Pro Plus 6.0軟件分別計(jì)算癌組織及癌旁組織中200倍視野下Bim蛋白陽性顆粒數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，陽性顆粒數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比為Bim相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)組織Bim蛋白表達(dá) 采用RIPA裂解液提取癌組織及癌旁組織蛋白，配制12.5%的分離膠和5%的濃縮膠，將蛋白加入梳孔進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，1.5 h后用5%的脫脂牛奶封閉，室溫1 h后加入一抗（Bim、GAPDH）4℃孵育過夜。TBST洗膜，二抗孵育1 h后用ECL試劑盒顯色發(fā)光。使用ImageJ軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析，計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-222-3p后769-P細(xì)胞Bim蛋白表達(dá) 將769-P細(xì)胞按每孔5×104個(gè)接種在6孔板上，將200 pmol的 miR-NC mimic，miR-222-3p mimic用溶于Opti-MEM的Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染769-P細(xì)胞，培養(yǎng)6 h后換成含2%胎牛血清的1640繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，用PBS洗滌2遍后提取總蛋白質(zhì)。將蛋白提取液用12.5%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜。用Bim、GAPDH單克隆抗體孵育過夜，TBST洗膜后二抗孵育1 h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。使用ImageJ軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

1.2.7 qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染 miR-222-3p后769-P細(xì)胞中Bim mRNA的表達(dá) Bim mRNA的定量PCR擴(kuò)增使用SYBR Green試劑，GAPDH作為內(nèi)參，其相對(duì)表達(dá)用2－ΔΔCT法表示，其中 ΔCT＝CtBim－CtGAPDH，ΔΔCT＝ΔCT腎癌組織－ΔCT癌旁組織。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染 miR-222-3p后769-P細(xì)胞的凋亡水平 將769-P細(xì)胞按每孔5×104個(gè)接種在6孔板上，將200 pmol的 miR-NC mimic，miR-222-3p mimic用溶于Opti-MEM的Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染769-P細(xì)胞，培養(yǎng)6 h后換成含2%胎牛血清的1640繼續(xù)培養(yǎng)48 h。將細(xì)胞用PBS洗滌2遍后，按照凋亡試劑盒說明書步驟將PI和Annexin-V加入細(xì)胞中孵育20 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎細(xì)胞癌組織中miR-222-3p的表達(dá)水平顯著升高

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，腎細(xì)胞癌組織中miR-222-3p表達(dá)水平顯著高于癌旁對(duì)照組織（圖1）。

2.2 Bim是miR-222-3p的直接靶點(diǎn)

靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果表明，miR-222-3p與促凋亡基因Bim mRNA 3′-UTR的第4052－4059位堿基序列（AUGUAGCA）互補(bǔ)結(jié)合（圖2），提示 Bim可能是miR-222-3p的靶點(diǎn)。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)腎細(xì)胞癌組織和癌旁組織中m iR-222-3p的表達(dá)水平

為驗(yàn)證Bim是miR-222-3p直接作用的靶基因，我們克隆了包含miR-222-3p結(jié)合位點(diǎn)的 Bim 3′-UTR序列，并將該序列插入到攜帶熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒中，然后在人胚腎細(xì)胞293T進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。結(jié)果顯示，與miR-NCmimic和空載β-gal相比，轉(zhuǎn)染 miR-222-3p mimic和含有 Bim的3′-UTR區(qū)域的質(zhì)粒后，熒光強(qiáng)度明顯降低（P＜0.01）。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-222-3p對(duì)含Bim 3′-UTR區(qū)的熒光活性的抑制是由于與該位點(diǎn)的結(jié)合所致，我們將Bim的3′-UTR區(qū)序列AUGUAGCA突變?yōu)閁ACAUCGA。同上述的轉(zhuǎn)染方法，同時(shí)轉(zhuǎn)染含有Bim的3′-UTR區(qū)域突變體質(zhì)粒和化學(xué)合成的miR-222-3p mimic。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，熒光素酶活性沒有變化（圖3）。上述結(jié)果證明miR-222-3p通過特異性地識(shí)別并結(jié)合Bim的3′-UTR區(qū)域靶向調(diào)節(jié)Bim表達(dá)。

圖2 m iR-222-3p與Bim m RNA靶位點(diǎn)配對(duì)示意圖

圖3 熒光素酶活性檢測(cè)

2.3 Bim蛋白在腎細(xì)胞癌組織中表達(dá)明顯下降

免疫組化結(jié)果顯示，癌旁組織可見大量棕黃色顆粒，Bim蛋白表達(dá)強(qiáng)；癌組織中則分布少量或不可見的棕黃色顆粒，Bim蛋白表達(dá)弱（圖4）；光密度分析結(jié)果顯示，癌組織與癌旁組織之間Bim蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，癌組織中Bim蛋白的表達(dá)明顯減低（P＜0.01，圖5）。說明 Bim蛋白在腎細(xì)胞癌組織中表達(dá)下調(diào)，這與miR-222-3p的表達(dá)水平相反。

圖4 免疫組化檢測(cè)腎癌組織Bim蛋白表達(dá)（×200）

圖5 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)腎癌組織Bim蛋白表達(dá)

2.4 miR-222-3p降低769-P細(xì)胞Bim蛋白的表達(dá)

為進(jìn)一步證實(shí)miR-222-3p對(duì)Bim的負(fù)向調(diào)控作用，在769-P細(xì)胞瞬時(shí)過表達(dá)miR-222-3p后，發(fā)現(xiàn)Bim蛋白水平明顯下調(diào)（圖6），而Bim mRNA水平無明顯變化（圖7），提示miR-222-3p對(duì)Bim的調(diào)控是經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控。

2.5 miR-222-3p降低769-P細(xì)胞的凋亡水平

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染 miR-NC mimic相比，轉(zhuǎn)染miR-222-3p mimic后769-P細(xì)胞凋亡水平明顯下降（圖8）。

圖6 瞬時(shí)過表達(dá)m iR-222-3p后769-P細(xì)胞Bim蛋白表達(dá)

圖7 瞬時(shí)過表達(dá)m iR-222-3p后769-P細(xì)胞Bim mRNA表達(dá)

圖8 Annexin V/PI染色法檢測(cè)769-P細(xì)胞的凋亡水平

3 討論

近年來對(duì)腎細(xì)胞癌相關(guān)miRNA差異性表達(dá)的研究揭示，miRNA與腎細(xì)胞癌密切相關(guān)，并在腎細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的生理病理功能。Arai等[16]發(fā)現(xiàn)miR-10a-5p的低表達(dá)、紡錘體和著絲粒相關(guān)蛋白1（SKA1）的高表達(dá)與腎細(xì)胞癌患者的總生存率顯著相關(guān)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-10a-5p不僅可以下調(diào)SKA1的過表達(dá)，而且與腎細(xì)胞癌的發(fā)生和臨床酪氨酸激酶抑制劑治療抵抗緊密相關(guān)。我們課題組研究發(fā)現(xiàn)miR-28-5p通過抑制RAP1B（Ras相關(guān)的小 GTP結(jié)合癌蛋白）表達(dá)并影響RAP1B下游MAPK信號(hào)通路中的兩種激酶的活化對(duì)腎細(xì)胞癌的發(fā)生起促進(jìn)作用[17]。研究報(bào)道m(xù)iR-222-3p在腎透明細(xì)胞癌患者血漿中表達(dá)水平升高，是一個(gè)促癌miRNA[8]，但其在組織中的表達(dá)尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示腎細(xì)胞癌組織中的miR-222-3p表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，進(jìn)一步說明miR-222-3p在腎細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用。

miR-222-3p的生理病理功能并不完全清楚。有報(bào)道顯示，miRNA-19b/221/222可通過下調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）的水平促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成，顯示miR-222-3p參與病理情況下血管結(jié)構(gòu)變化的過程[18]。Nardelli等[19]通過芯片技術(shù)檢測(cè)肥胖妊娠和非肥胖妊娠婦女羊膜間質(zhì)干細(xì)胞中多個(gè)miRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-138/miR-222在肥胖妊娠婦女中高表達(dá)，這一結(jié)果提示可以通過改變飲食結(jié)構(gòu)調(diào)整羊膜干細(xì)胞中miRNA的表達(dá)水平，為新生兒肥胖及肥胖相關(guān)代謝紊亂疾病提供新的治療思路。Terasawa等[12]則發(fā)現(xiàn)miR-222與PC12細(xì)胞凋亡有關(guān)。

Bim是Bcl-2家族中BH3-only亞家族的一員，是一種重要的促凋亡蛋白。研究表明Bim表達(dá)的缺失與多種腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑是一種用來治療有EGFR突變的晚期非小細(xì)胞肺癌患者的藥物，Zhao等[20]發(fā)現(xiàn)Bim缺失使其藥效降低。Maimaiti等[21]發(fā)現(xiàn)Bim表達(dá)缺失與乳腺癌尤其是luminal A型乳腺癌患者不良預(yù)后有關(guān)。Zantl等[22]發(fā)現(xiàn)Bim的丟失與腎細(xì)胞癌化療抵抗有關(guān)。這些研究充分說明Bim是一個(gè)重要的腫瘤抑制因子。本研究首先通過生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)miR-222-3p與Bim mRNA的3′-UTR有結(jié)合位點(diǎn)，并通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-222-3p可以直接作用于Bim的3′-UTR序列。同時(shí)應(yīng)用免疫組化和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)了腎細(xì)胞癌組織中Bim蛋白表達(dá)情況，兩者結(jié)果均顯示Bim蛋白在腎細(xì)胞癌組織顯著降低，這與miR-222-3p的表達(dá)水平相反。進(jìn)一步使用轉(zhuǎn)染技術(shù)實(shí)現(xiàn)769-P細(xì)胞過表達(dá)miR-222-3p，檢測(cè)769-P細(xì)胞Bim蛋白及mRNA的變化，證實(shí)miR-222-3p對(duì)Bim的調(diào)節(jié)是經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說明miR-222-3p可以降低769-P細(xì)胞的凋亡水平，對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示miR-222-3p是腎細(xì)胞癌中一個(gè)重要的促癌基因，通過下調(diào)抑癌基因Bim的表達(dá)抑制腎癌細(xì)胞的凋亡，參與腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。miR-222-3p/Bim軸為治療腎細(xì)胞癌提供了新思路。

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