劉磊，王佳偉，2

腦血管病嚴(yán)重威脅著人類健康和生命，約68%的缺血性腦血管病患者伴有動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）[1]。一項AS危險因子調(diào)查提示人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）感染是免疫功能正常人群發(fā)生AS的獨立危險因子[2]。而HCMV脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）主要見于AS斑塊內(nèi)皮及血管平滑肌細(xì)胞核內(nèi)[3]。許多急性心腦血管事件源于易損斑塊破裂[4]。已知HCMV感染后，可使血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）釋放大量血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）[5]，后者可促進(jìn)血管新生及滲漏，最終導(dǎo)致斑塊破裂。本研究通過HCMV感染人腦VSMC，隨后干擾其感染后再激活的標(biāo)志——長單一序列區(qū)（unique long region 83，UL83）基因，探索該基因?qū)Υ傺苌伤?1（angiopoietin-1，Ang-1）、促血管生成素-2（angiopoietin-2，Ang-2）以及VEGF-A表達(dá)的影響及其與血管新生可能存在的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料 病毒和細(xì)胞株HCMV AD169株（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院）；人腦VSMC（ScienCell）；擴增病毒所需人胚肺成纖維細(xì)胞（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院）。

主要試劑：人腦VSMC培養(yǎng)基，多聚賴氨酸（ScienCell）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清（Hyclone）；Lipofectamin 2000；Opti-MEM，TRIZOL Reagent，SuperScript II Reverse Transcriptase（Invitrogen）；BCA蛋白定量試劑盒（Pierce）；胰蛋白酶（Merck）；Taq DNA Polymerase，dNTP（Takara）；抗體：抗HCMV pp65、抗人Ang-1、Ang-2、VEGF-A（Abcam）；抗人β-actin（Santa Crz）。

1.2 人胚肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞置于含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長至鋪滿90%后，以0.25%胰蛋白酶對細(xì)胞進(jìn)行消化，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

表1 RT-PCR引物設(shè)計與合成（上海生物工程公司）

表2 HCMV UL83基因siRNA設(shè)計與合成（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）

1.3 病毒擴增與毒力滴定 將10～15代人胚肺成纖維細(xì)胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長至80%匯合狀態(tài)時接種HCMV AD169病毒液，感染滴度為5 0半數(shù)細(xì)胞感染量（median tissue cultureinfective dose，TCID50）＝10-5/0.1 ml，當(dāng)完全出現(xiàn)細(xì)胞病變（cytopathogenic effect，CPE）時收集細(xì)胞，凍存于-70℃?zhèn)溆?。將系列稀釋好的病毒液接種于含人胚肺成纖維細(xì)胞的96孔板中，每個稀釋度滴定6個復(fù)孔，每孔100 μl。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～10 d。每天觀察并記錄出現(xiàn)CPE（細(xì)胞病變）的孔數(shù)，直到CPE不再發(fā)展為止，進(jìn)行毒力測定。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測小干擾核糖核酸轉(zhuǎn)染人腦VSMC 6 h后轉(zhuǎn)染效率 將人腦VSMC以2×105/孔密度接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)40 h。轉(zhuǎn)染前2 h，將陳舊培養(yǎng)基吸出，每孔加入1.5 ml不含抗生素及血清的人腦VSMC培養(yǎng)基；將10 μl 20 μM FAM熒光標(biāo)記小干擾核糖核酸（small interfering ribonucleic acid，siRNA）與250 μl Opti-MEM在EP管中混合；將Lipofectamine 2000輕柔搖勻，取5 μl與稀釋的siRNAs混合均勻，室溫靜置20 min，形成siRNA——轉(zhuǎn)染試劑混合物。將siRNA——轉(zhuǎn)染試劑混合物加入6孔板中，使siRNAs終濃度為100 nM，輕輕搖動6孔板使其混合均勻；將6孔板置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，6 h后吸出上清。胰酶消化后制備血細(xì)胞懸濁液，使用流式細(xì)胞儀檢測siRNA轉(zhuǎn)染效率。

1.5 HCMV感染人腦VSMC后干擾UL83基因表達(dá)實驗分組 此部分實驗共分6組進(jìn)行：①空白組（未接毒未轉(zhuǎn)染），②接毒組（只接毒未轉(zhuǎn)染），③接毒無效干擾組，④接毒干擾S1靶點組，⑤接毒干擾S2靶點組，⑥接毒干擾S3靶點組。最終篩選出干擾效率最高的靶點。

1.5.1 HCMV AD169感染 將人腦VSMC以2×105/孔密度接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h；使用HCMV AD169（MOI=10）病毒液吸附人腦VSMC，每孔加入病毒液約1 ml，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育1 h后吸走殘余病毒液；加入含4%胎牛血清培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)16 h。

1.5.2 siRNA轉(zhuǎn)染HCMV AD169感染后人腦VSMC 將無效干擾siRNA以及針對UL83基因S1、S2、S3靶點siRNA分別轉(zhuǎn)染至感染后人腦VSMC。再加入含4%胎牛血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h或72 h。

1.5.3 RT-PCR檢測各組UL83基因mRNA表達(dá)情況 Trizol法提取總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，得到的cDNA用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）反應(yīng)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）為內(nèi)參，檢測各組U L 8 3基因信使R N A（messenger RNA，mRNA）的表達(dá)。

1.5.4 Western Blot檢測各組UL83基因編碼pp65蛋白表達(dá) 以1500rpm離心5 min收集人腦VSMC后用PBS洗滌2次。向各組加入細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，于冰上放置30 min后，以12 000 rpm離心20 min。將離心獲得上清中的蛋白進(jìn)行BCA定量后，加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸5 min變性處理。各組蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上進(jìn)行Western Blot檢測。以β-actin作為內(nèi)參蛋白。對曝光膠片進(jìn)行掃描，用ImageJ 1.38x圖像分析系統(tǒng)對每例樣品的不同蛋白條帶分別進(jìn)行面積和平均灰度的測量，以二者乘積表示某樣品中某蛋白的絕對含量；將其與內(nèi)參（該樣品中actin蛋白的絕對含量）之比作為最終蛋白含量測量數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.6 HCMV感染人腦VSMC后各時間點Ang-1，Ang-2以及VEGF-A表達(dá)情況 參照前述方法，分別采用RT-PCR及Western Blot對HCMV感染人腦VSMC后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h以及72 h Ang-1、Ang-2、VEGF-A的mRNA及蛋白進(jìn)行檢測。

1.7 HCMV感染人腦VSMC后UL83基因高效干擾組Ang-1、Ang-2以及VEGF-A表達(dá)情況此部分實驗共分4組進(jìn)行：①空白組（未接毒未轉(zhuǎn)染），②接毒高效干擾組，③接毒無效干擾組，④接毒組（只接毒未轉(zhuǎn)染）。

RT-PCR檢測各組干擾48 h后Ang-1，Ang-2及VEGF-A的mRNA表達(dá)情況。

Western Blot檢測各組干擾72 h后Ang-1，Ang-2及VEGF-A蛋白表達(dá)情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 使用中位數(shù)描述非正態(tài)分布資料，對于正態(tài)分布資料使用

表示其平均水平。每項實驗重復(fù)3遍。SSPS 14.0軟件應(yīng)用秩和檢驗進(jìn)行總體和（或）組間比較分析。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染人腦VSMC 6 h后轉(zhuǎn)染效率流式細(xì)胞儀顯示細(xì)胞懸濁液當(dāng)中95.59%人腦VSMC內(nèi)有FAM熒光標(biāo)記siRNA，表明轉(zhuǎn)染效率理想，該脂質(zhì)體介導(dǎo)化學(xué)合成siRNA轉(zhuǎn)染體系可靠。

2.2 siRNA干擾48 h后各組UL83基因mRNA表達(dá)效率 HCMV感染人腦VSMC后18 h轉(zhuǎn)染siRNA，轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞。結(jié)果顯示分別轉(zhuǎn)染siRNA的S1、S2、S3組中UL83mRNA表達(dá)與接毒組相比均被抑制，分別為后者的62.5%、27.6%和21.3%；空白組由于未接毒，故不表達(dá)UL83mRNA；接毒無效干擾組UL83mRNA表達(dá)量為接毒組93.7%（圖1A）。因此，S2及S3干擾UL83基因轉(zhuǎn)錄mRNA的效率最高，分別為72.4%和78.7%。

2.3 siRNA干擾72 h后各組UL83基因編碼pp65蛋白表達(dá)效率 HCMV感染人腦VSMC后18 h轉(zhuǎn)染siRNA，轉(zhuǎn)染后72 h收集細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)分別轉(zhuǎn)染siRNA的S1、S2、S3組中UL83編碼pp65蛋白表達(dá)與接毒組相比均被抑制，分別為后者的68.2%、25.4%和18.7%；空白組由于沒有接毒，因此不表達(dá)pp65蛋白；接毒無效干擾組pp65蛋白表達(dá)量為接毒組96.3%（圖1B）。因此S2及S3干擾UL83基因編碼pp65蛋白效率最高，分別為74.6%和81.3%。

圖1 HCMV AD169（MOI＝10）感染人腦VSMC后各組UL83 mRNA和UL83基因編碼pp65蛋白的表達(dá)情況

2.4 HCMV感染人腦VSMC 0～72h后Ang-1、Ang-2以及VEGF-A mRNA表達(dá)變化Ang-1 mRNA在感染后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h相對表達(dá)量分別為0.768±0.007，0.712±0.009，0.542±0.003，0.436±0.006，0.302±0.004和0.287±0.008（組間P＜0.01）。

Ang-2 mRNA在感染后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h相對表達(dá)量分別為0.213±0.002，0.286±0.004，0.364±0.002，0.638±0.004，0.827±0.015，0.852±0.017（組間P＜0.01）。

VEGF-A mRNA在感染后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h相對表達(dá)量分別為0.201±0.003、0.292±0.007、0.317±0.009、0.527±0.008、0.754±0.016、0.801±0.014（組間P＜0.01）（圖2A）。

圖2 HCMV AD169（MOI＝10）感染人腦VSMC后不同時間點Ang-1、Ang-2及VEGF-A mRNA表達(dá)變化

2.5 HCMV感染人腦VSMC 0～72 h后Ang-1、Ang-2及VEGF-A蛋白表達(dá)變化 Ang-1蛋白在感染后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h相對表達(dá)量分別為1.215±0.006、1.172±0.004、0.984±0.007、0.785±0.005、0.638±0.007、0.614±0.003（組間P＜0.01）。

Ang-2蛋白在感染后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h相對表達(dá)量分別為0.593±0.003、0.645±0.006、0.732±0.007、0.917±0.006、1.035±0.009、1.270±0.012（組間P＜0.01）。

VEGF-A蛋白在感染后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h相對表達(dá)量分別為0.483±0.005、0.627±0.006、0.675±0.008、0.752±0.010、1.187±0.013、1.213±0.018（組間P＜0.01）（圖2B）。

2.6 HCMV感染人腦VSMC后UL83基因高效干擾組Ang-1，Ang-2以及VEGF-A mRNA表達(dá)情況 Ang-1 mRNA在空白組、接毒高效干擾組、接毒無效干擾組及接毒組的相對表達(dá)量分別為0.875±0.004、0.832±0.003、0.289±0.002、0.276±0.005。接毒高效干擾組分別與接毒無效干擾組及接毒組相比，組間P值均＜0.01。

Ang-2 mRNA在空白組、接毒高效干擾組、接毒無效干擾組及接毒組的相對表達(dá)量分別為0.312±0.007、0.304±0.006、0.873±0.008、0.921±0.012。接毒高效干擾組分別與接毒無效干擾組及接毒組相比，組間P值均＜0.01。

VEGF-A mRNA在空白組、接毒高效干擾組、接毒無效干擾組及接毒組的相對表達(dá)量分別為0.272±0.003、0.284±0.012、0.753±0.009、0.791±0.008。接毒高效干擾組分別與接毒無效干擾組及接毒組相比，組間P值均＜0.01（圖3A）。

2.7 HCMV感染人腦VSMC后UL83基因高效干擾組Ang-1，Ang-2及VEGF-A蛋白表達(dá)情況

Ang-1蛋白在空白組、接毒高效干擾組、接毒無效干擾組及接毒組的相對表達(dá)量分別為0.838±0.009、0.775±0.006、0.192±0.004、0.018±0.003。接毒高效干擾組分別與接毒無效干擾組及接毒組相比，組間P值均＜0.01。

Ang-2蛋白在空白組、接毒高效干擾組、接毒無效干擾組及接毒組的相對表達(dá)量分別為0.593±0.008、0.784±0.003、1.274±0.004、1.342±0.003。接毒高效干擾組分別與接毒無效干擾組及接毒組相比，組間P值均＜0.01。

VEGF-A在空白組、接毒高效干擾組、接毒無效干擾組及接毒組的相對表達(dá)量分別為0.542±0.005、0.779±0.003、1.373±0.006、1.392±0.002。接毒高效干擾組分別與接毒無效干擾組及接毒組相比，組間P值均＜0.01（圖3B）。

3 討論

HCMV屬于皰疹病毒β亞科，是免疫抑制、器官移植患者的嚴(yán)重致病、致死因素[6]。目前，HCMV慢性感染及其潛伏感染再激活與動脈粥樣硬化之間的關(guān)系也日益得到學(xué)術(shù)界的重視。HCMVUL83基因編碼65kDa的磷酸化蛋白pp65（phosphoprotein 65）在病毒潛伏－再激活感染狀態(tài)中起著關(guān)鍵作用。國際公認(rèn)將pp65抗原檢測定為明確HCMV激活感染的標(biāo)準(zhǔn)方法。本課題組前期發(fā)現(xiàn)HCMVUL83基因通過某種途徑激活了血管緊張素ⅡAT1受體基因表達(dá)，由于已知后者通過結(jié)合血管緊張素Ⅱ經(jīng)NF-B信號途徑影響易損斑塊穩(wěn)定性，因此提示HCMV感染后，UL83基因與易損斑塊的穩(wěn)定性可能存在密切關(guān)系[7]。

易損斑塊與穩(wěn)定斑塊相比，存在明顯的血管新生現(xiàn)象。斑塊內(nèi)的新生血管大多是不成熟的，由于缺乏細(xì)胞間的緊密連接，因此容易發(fā)生滲漏，使得炎癥細(xì)胞和紅細(xì)胞進(jìn)入斑塊甚至血管腔[8-9]。血管新生需要多種因子參與，其中VEGF-A是公認(rèn)最有效、快速的血管滲透機制誘導(dǎo)因子。Ang是第一個被確定來源于人腫瘤組織并具有促血管生成作用的細(xì)胞因子家族[10]，其中Ang-1、Ang-2與血管生成關(guān)系最為密切。質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)HCMV的分泌蛋白質(zhì)組包括1000多種由該病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的促進(jìn)血管和組織修復(fù)的新生蛋白，其中包括VEGF及Ang[11]。

圖3 空白組、接毒高效干擾組、接毒無效干擾組和接毒組HCMV AD169（MOI＝10）感染人腦VSMC后Ang-1、Ang-2及VEGF-A的mRNA和蛋白的表達(dá)情況

目前已知Ang-1和Ang-2及其受體Tie-2對新生血管的成熟至關(guān)重要。Ang-1和Ang-2主要由包括人腦VSMC、血管周細(xì)胞在內(nèi)的壁細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生。其中Ang-1是Tie-2生理狀態(tài)下的主要配體，參與調(diào)控新生血管的管徑和數(shù)目，并通過增加內(nèi)皮細(xì)胞和壁細(xì)胞的聯(lián)系來達(dá)到穩(wěn)定新生血管，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，減少其滲漏[12-13]。Ang-2作為Ang-1拮抗劑，雖也可結(jié)合Tie-2，但不引起后者磷酸化，從而使內(nèi)皮細(xì)胞容易對VEGF等促生長因子發(fā)生反應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤血管生長。此外，Ang-2的作用相比Ang-1更具有多樣性：在沒有VEGF存在的情況下，Ang-2拮抗Ang-1，使血管退化；而當(dāng)VEGF存在時，Ang-2則促進(jìn)新生血管出芽[14]。目前已經(jīng)在易損斑塊內(nèi)發(fā)現(xiàn)Ang-2/Ang-1比例升高[15]。血管新生依賴于內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖以及血管周細(xì)胞對新生血管芽的包裹覆蓋，這一過程需要VEGF和血小板源性生長因子（plateletderived growth factor，PDGF）的相互協(xié)調(diào)[16]。VEGF不僅干擾內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接而且通過抑制PDGF介導(dǎo)血管周細(xì)胞覆蓋新生血管芽來干擾新生血管的成熟[17-18]。本實驗表明，人腦VSMC被HCMV感染后的極早期（6 h后），其本身便創(chuàng)造了促進(jìn)血管新生并阻礙其成熟的微環(huán)境，即Ang1表達(dá)下調(diào)，而Ang-2及VEGF-A表達(dá)上調(diào)，并且這一趨勢隨時間而延續(xù)。但是，本實驗沒有觀察到Ang-2較VEGF提前表達(dá)這一在腫瘤組織和動物腦缺血后血管新生模型當(dāng)中遇到的現(xiàn)象[19]。

本實驗中接毒有效干擾組Ang-1、Ang-2、VEGF-A mRNA及蛋白表達(dá)量受到明顯抑制，表明UL83基因至少在HCMV感染18 h后參與了上述基因表達(dá)的變化，反向證明UL83基因參與創(chuàng)造促進(jìn)血管新生并阻礙其成熟的微環(huán)境。

未來為了進(jìn)一步明確UL83基因作用，還需正向單獨轉(zhuǎn)染其進(jìn)入人腦VSMC，觀察并印證Ang-1、Ang-2、VEGF-A的后續(xù)表達(dá)情況。此外，在正向及反向?qū)嶒灳C實UL83基因?qū)ng-1、Ang-2、VEGF-A表達(dá)的作用基礎(chǔ)上，應(yīng)當(dāng)繼續(xù)探討UL83基因是通過具體哪一種信號途徑參與到上述病理生理過程的。

[1] PACIARONI M，CASO V，VENTI M，et al.Outcome in patients with stroke associated with internal carotid artery occlusion[J].Cerebrovasc Dis，2005，20（2）：108-113.

[2] SORLIE P D，ADAM E，MELNICK S L，et al.Cytomegalovirus/herpesvirus and carotid atherosclerosis：the ARIC Study[J].J Med Virol，1994，42（1）：33-37.

[3] CHEN R Z，XIONG S D，YANG Y Z，et al.The relation between human cytomegalovirus infection and atherosclerosis development[J].Molecular and Celluar Biochemistry，2003，249：91-96.

[4] STOLL G，BENDSZUS M.Inflammation and atherosclerosis：novel insights into plaque formation and destabilization[J].Stroke，2006，37（7）：1923-1932.

[5] REINHARDT B，SCHAARSCHMIDT P，BOSSERT A，et al.Upregulation of functionally active vascular endothelial growth factor by human cytomegalovirus[J].J Gen Virol，2005，86（1）：23-30.

[6] SWEET C.The pathogenicity of cytomegalovirus[J].FEMS Microbiol Rev，1999，23（4）：457-482.

[7] WANG J，TUO H，WANG R，et al.The expression of human brain vascular smooth muscle cell AT receptor after the UL83 gene of HCMV inhibition by small interfering RNAs[J].Neurol Res，2008，30（9）：903-909.

[8] DUNMORE B J，MCCARTHY M J，NAYLOR A R，et al.Carotid plaque instability and ischemic symptoms are linked to immaturity of microvessels within plaques[J].J Vasc Surg，2007，45（1）：155-159.

[9] SLUIMER J C，KOLODGIE F D，BIJNENS A P，et al.Thin-walled microvessels in human coronaryatherosclerotic plaques show incomplete endothelial junctions relevance of compromised structural integrity for intraplaque microvascular leakage[J].J Am Coll Cardiol，2009，53（17）：1517-1527.

[10] FETT J W，STRYDOM D J，LOBB R R，et al.Isolation and characterization of angiogenin，an angiogenic protein from human carcinoma cells[J].Biochemistry，1985，24（20）：5480-5486.

[11] DUMORTIER J，STREBLOW D N，MOSES A V，et al.Human cytomegalovirus secretome contains factors that induce angiogenesis and wound healing[J].J Virol，2008，82（13）：6524-6535.

[12] DAVIS S，ALDRICH T H，JONES P F，et al.Isolation of angiopoietin-1，a ligand for the TIE2 receptor，by secretion-trap expression cloning[J].Cell，1996，87（7）：1161-1169.

[13] SURI C，MCCLAIN J，THURSTON G，et al.Increased vascularization in mice overexpressing angiopoietin-1.[J].Science，1998，282（5388）：468-471.

[14] HOLASH J，WIEGAND S J，YANCOPOULOS G D.New model of tumor angiogenesis：dynamic balance between vessel regression and growth mediated by angiopoietins and VEGF[J].Oncogene，1999，18（38）：5356-5362.

[15] POST S，PEETERS W，BUSSER E，et al.Balance between angiopoietin-1 and angiopoietin-2 is in favor of angiopoietin-2 in atherosclerotic plaques with high microvessel density[J].J Vasc Res，2008，45（3）：244-250.

[16] JAIN R K.Molecular regulation of vessel maturation[J].Nat Med，2003，9（6）：685-693.

[17] SUAREZ S，BALLMER-HOFER K.VEGF transiently disrupts gap junctional communication in endothelial cells[J].J Cell Sci，2001，114（PT6）：1229-1235.

[18] GREENBERG J I，SHIELDS D J，BARILLAS S G，et al.A role for VEGF as a negative regulator of pericyte function and vessel maturation[J].Nature，2008，456（7223）：809-813.

[19] YANCOPOULOS G D，DAVIS S，GALE N W，et al.Vascular-specific growth factors and blood vessel formation[J].Nature，2000，407（6801）：242-248.