趙良娟，張霞，劉國(guó)紅，鄭文杰

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300461）

民以食為天，食以安為先。肉及肉制品的質(zhì)量安全問(wèn)題是全世界共同關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。近年來(lái)，我國(guó)有一些不法企業(yè)使用相對(duì)廉價(jià)的豬肉、鴨肉等肉類原料，通過(guò)各種手段的深加工，冒充牛、羊肉制品進(jìn)行銷售以謀取不當(dāng)利益，嚴(yán)重侵犯了消費(fèi)者的合法權(quán)益。2013年初，歐洲的“馬肉風(fēng)波”[1]，使得消費(fèi)者“聞馬色變”，歐美的“魚肉風(fēng)波”又再一次拉響了肉及肉制品質(zhì)量安全的警鐘。檢測(cè)鑒別肉及肉制品中動(dòng)物源性成分的研究成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。

國(guó)內(nèi)外的學(xué)者應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）及實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)食品中牛、羊、馬、駱駝、豬、雞、鴨、火雞等動(dòng)物源成分進(jìn)行了有效鑒別[2-17]，我國(guó)于2016年發(fā)布了食品中鴨成分檢測(cè)的PCR方法[18]。

PCR技術(shù)是一種有效的DNA擴(kuò)增技術(shù)，但是PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)耗時(shí)、易污染、程序復(fù)雜、EB染色時(shí)對(duì)環(huán)境有危害。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有高效、快速的優(yōu)點(diǎn)，但是需要大型儀器設(shè)備和進(jìn)口試劑，價(jià)格昂貴，且對(duì)操作人員有較高的技術(shù)要求。

因此，開發(fā)低成本、易操作、具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度且環(huán)保的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法用于樣品初篩是食品摻假丞待解決的問(wèn)題，而且可以滿足食品安全現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)管和迅速響應(yīng)的需要，具有重要意義。

20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來(lái)的膠體金免疫層析法（gold immune chromagraphy assay）是一種快速的免疫學(xué)測(cè)定方法[19]，是膠體金標(biāo)記技術(shù)和免疫層析技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，基本原理是利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細(xì)管作用，使抗原抗體發(fā)生反應(yīng)，在檢測(cè)線位置，陽(yáng)性反應(yīng)在試紙條上出現(xiàn)紅色條帶，陰性反應(yīng)不顯色。

PCR結(jié)合可視化核酸試紙條方法通過(guò)核酸引物兩端修飾相應(yīng)標(biāo)記物（如生物素、熒光素），同時(shí)試紙條上相應(yīng)位置標(biāo)記對(duì)應(yīng)抗體，就可以實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的試紙條檢測(cè)。目前該技術(shù)已應(yīng)用于食品中致病菌的檢測(cè)[20-21]，具有快速、高效、成本低等優(yōu)勢(shì)。

本研究根據(jù)鴨線粒體基因組特異性基因片段設(shè)計(jì)引物，建立鴨成分快速檢測(cè)的PCR-免疫膠體金試紙條方法，為檢測(cè)和鑒別肉及肉制品中鴨成分提供一種快速、簡(jiǎn)便的分子生物學(xué)初篩方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

試驗(yàn)所用雞、鴨、鵪鶉、貓、狗、鼠、豬、馬、牛、水牛、羊、驢、鹿、駱駝、兔、貂、狐貍、胡蘿卜、白菜均為天津出入境檢驗(yàn)檢疫局提供。所有樣品經(jīng)基因組測(cè)序和比對(duì)確認(rèn)為相應(yīng)物種。

1.1.2 試劑

血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）、Loading buffer，DNA marker：天根生化科技有限公司；dNTP Mixture、10X PCRbuffer（Mg2+Plus）：普洛麥格生物技術(shù)有限公司；Taq DNA polymerase：TaKaRa生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖：sigma公司；核酸通用試紙條及展開液：北京華大蛋白研發(fā)中心有限公司。

1.1.3 設(shè)備

離心機(jī)（5417R）：Eppendorf公司；電泳儀（P25）：Biometra公司；PCR擴(kuò)增儀（T00）、凝膠成像儀（XR+）：Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

用天根生化科技有限公司血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型），按照試劑盒要求提取。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及標(biāo)記分子

根據(jù)NCBI中已經(jīng)發(fā)表的鴨線粒體基因組序列為依據(jù)，以鴨線粒體CytB區(qū)域?yàn)榘袠?biāo)，應(yīng)用Geneious 6.1序列分析軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)了一對(duì)鴨線粒體DNACytB區(qū)的引物，上下游引物分別用異硫氰酸熒光素（FITC）和生物素（biotin）標(biāo)記，上游引物為 F1，下游引物為R1，目的片段291 bp，引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)體系為：模板DNA 1.0 μL，PrimerF1/R1 0.8 μL，dNTP mixture 2.0 μL，10X PCRbuffer（Mg2+Plus）2.0 μL，Ex Taq Hot Start（TaKaRaTaqTM）0.2 μL，ddH2O 13.2μL，總體積20μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)后進(jìn)入72℃ 5 min。

1.2.4 試紙條檢測(cè)

取5 μL PCR產(chǎn)物點(diǎn)于核酸試紙條樣品墊，再滴加95 μL展開液進(jìn)行檢測(cè)，5分鐘后觀察結(jié)果。試紙條質(zhì)控帶出現(xiàn)紅色為有效結(jié)果，檢測(cè)帶出現(xiàn)紅色為可疑陽(yáng)性，檢測(cè)帶未出現(xiàn)紅色為陰性，可疑陽(yáng)性樣品需進(jìn)行測(cè)序或SN標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證。

1.2.5 電泳檢測(cè)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電壓100 V，電流110 mA，時(shí)間40 min，檢測(cè)有無(wú)目的條帶。

1.2.6 方法特異性

以鴨肉基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照品，選擇雞，鵪鶉，貓，狗，鼠，豬，馬，牛，水牛，羊，驢，鹿，駱駝，兔，貂、狐貍及植物樣品胡蘿卜、白菜等的基因組DNA為陰性對(duì)照，以無(wú)菌水為空白對(duì)照，用建立的PCR-試紙條方法進(jìn)行檢測(cè)，并同時(shí)進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.7 方法的實(shí)際靈敏度

以鴨肉為陽(yáng)性樣品，牛肉模擬摻假樣品，制備鴨肉/牛肉的混合模擬樣品，以鴨肉肉粉的質(zhì)量百分比為100%、50%、25%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%、0.001%比例混勻，提取基因組DNA，用建立的PCR-試紙條方法進(jìn)行檢測(cè)，并同時(shí)進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.8 市售肉及肉制品的檢測(cè)

應(yīng)用所建立的可視化試紙條方法對(duì)市售不同品牌的烤鴨、鴨脖、鴨爪、鴨翅制品、羊肉片、羊肉卷等30份肉及肉制品進(jìn)行測(cè)試，檢測(cè)結(jié)果與現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的特異性

以1.2.3 PCR-試紙條反應(yīng)體系及程序進(jìn)行引物特異性檢測(cè)，電泳及試紙條結(jié)果如圖1所示。

圖1 鴨源性成分引物特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Results of species specificity of PCR with duck primers

鴨肉樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)為291 bp擴(kuò)增片段，試紙條檢測(cè)質(zhì)控帶紅色，檢測(cè)帶紅色，結(jié)果為可疑陽(yáng)性。試紙條檢測(cè)可疑陽(yáng)性的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)測(cè)序、比對(duì)，結(jié)果顯示與鴨序列具有99%同源性。

其他動(dòng)植物樣品均只有質(zhì)控帶紅色，檢測(cè)帶無(wú)條帶，試紙條檢測(cè)結(jié)果與電泳結(jié)果一致，表明該方法特異性好，能對(duì)鴨成分進(jìn)行有效擴(kuò)增與檢測(cè)。

2.2 方法靈敏度

以上述PCR-試紙條反應(yīng)體系及程序進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，電泳及試紙條結(jié)果如圖2所示。

圖2 鴨源性成分實(shí)際靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of sensitivity of duck specifes

PCR-試紙條檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)鴨肉在混合肉品中的比例為100%、50%、25%、10%、5%、1%、0.1%時(shí)，試紙條質(zhì)控線和檢測(cè)線均能顯示紅色條帶；最低檢測(cè)限可達(dá)0.1%。

2.3 市售肉及肉制品的檢測(cè)

應(yīng)用所建立的可視化試紙條方法對(duì)市售不同品牌的烤鴨、鴨脖、鴨爪、鴨翅制品和羊肉片、羊肉卷等肉及肉制品進(jìn)行實(shí)際樣品測(cè)試，結(jié)果見表1

表1 市售樣品檢測(cè)結(jié)果Table 1 Result of sample in the market

由表1可知，檢測(cè)結(jié)果與現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明所建立的PCR-可視化核酸試紙條方法能夠快速檢測(cè)肉及肉制品的鴨源性成分。

3 結(jié)論

本文以鴨線粒體基因組序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)其ATP8-ATP6基因區(qū)間的物種特異性引物，并在兩端標(biāo)記異硫氰酸鹽（Fluorescein 5-isothiocyanate，F(xiàn)ITC）和生物素（Biotin），用含有金標(biāo)記的抗異硫氰酸鹽的兔多克隆抗體和固定有鏈親和素的通用核酸檢測(cè)試紙條對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行篩選檢測(cè)，從而建立了食品中鴨成分快速檢測(cè)的PCR-可視化核酸試紙條方法。

對(duì)鴨樣品的擴(kuò)增結(jié)果說(shuō)明，只有鴨成分的樣品擴(kuò)增出291 bp特異性目的條帶，試紙條檢測(cè)線變紅，而其它常見動(dòng)植物樣品雞、鵪鶉、貓、狗、鼠、豬、馬、牛、水牛、羊、驢、鹿、駱駝、兔、貂、狐貍、胡蘿卜、白菜等均無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶，試紙條檢測(cè)線未變紅色，試紙條檢測(cè)結(jié)果與電泳結(jié)果一致，這表明所設(shè)計(jì)的鴨特異性引物具有較好的物種特異性。從靈敏度試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，該試驗(yàn)PCR-試紙條檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到0.1%，比電泳高10倍，表明方法具有較強(qiáng)的靈敏度。

應(yīng)用所建立的可視化核酸試紙條方法對(duì)市售不同品牌的烤鴨、鴨脖、鴨爪、鴨翅制品和羊肉片、羊肉卷等30份肉及肉制品進(jìn)行實(shí)際樣品測(cè)試，烤鴨、鴨脖、鴨爪和鴨翅均檢測(cè)出鴨源成分，10份羊肉片中2份檢出鴨源成分，10份羊肉卷中3份檢出鴨源成分，檢測(cè)結(jié)果與現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果一致。說(shuō)明所建立的PCR-可視化核酸試紙條方法能夠快速檢測(cè)肉及肉制品的鴨源性成分，而且市售羊肉片、羊肉卷存在不同程度的摻假，與標(biāo)簽成分不符合現(xiàn)象。

可視化核酸試紙條法充分利用PCR檢測(cè)的高靈敏度、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，又結(jié)合了免疫金標(biāo)試紙條簡(jiǎn)便、快捷、成本低的優(yōu)勢(shì)，為檢測(cè)和鑒別食品中鴨成分提供一種快速、簡(jiǎn)便、低成本的分子生物學(xué)初篩方法，能夠?qū)崿F(xiàn)食品中鴨成分的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，進(jìn)而為食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支持與保障。

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