劉 麗，楊紅梅，劉惠文，尹 東，王天鵬，封 靜，袁曉超，俞海龍

在我國發(fā)病率逾為70%[1]的牙周炎疾病其主要病理變化是牙槽骨的吸收，從而加速了牙齒的松動脫落,基礎治療和手術不能完全控制病情遷延[2]。國內外學者在不同領域對甘草的研究表明，甘草具有抗菌、抗病毒、鎮(zhèn)咳、抗癌、增強免疫力及促進骨的重建和代謝等諸多活性[3]。骨堿性磷酸酶(BALP)出現(xiàn)于骨基質成熟期，是骨形成中期指標，是成骨細胞膜上的一種蛋白，在骨形成及骨礦化過程中起很重要的作用。BALP在血中的濃度能反映骨形成的速率[4]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP-4)是轉化生長因子TGF-β超家族成員之一，它在成骨細胞的增殖、生長、分化過程中具有誘導活性，進而加速破壞骨的修復重建，在骨形成初期具有極為關鍵的調節(jié)作用[5]。本研究將通過局部結扎絲刺激聯(lián)合黏結牙石加混合菌感染大鼠牙周并高糖飲食的方法建立大鼠牙周炎模型[6]，然后對模型給予甘草液干預，并通過酶聯(lián)免疫吸附法對建模前，建模后以及甘草水煎液干預模型后大鼠血清中骨代謝指標BALP、BMP-4進行檢測分析，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選用清潔二級10周齡SD大鼠，雄性，體重(230±20)g。

1.2 藥物及儀器：甘草飲片(購自寧夏古方中醫(yī)藥品超市)和蒸餾水1∶10(W∶V)混合，沸水回流5 h，濾渣后收集提取液。試劑：BALP和BMP-4酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)。儀器為分光儀。

1.3 實驗方法： ①將30只體重220～260 g雄性8周齡清潔級大鼠全部斷尾取血1 mL并標記為第1組血樣，將其全部離心取上清液-80 ℃保存。②隨后將30只大鼠分為建模組26只和陰性對照組4只。建模組大鼠經10 g/L戊巴比妥3 mg/kg腹腔注射麻醉、固定。采用0.2 mm正畸用結扎絲結扎SD大鼠右側上下頜磨牙牙頸部1圈，于頰側擰緊，將結扎頭置于牙齦溝內。此后將重度牙周病患者牙石碾碎，與其齦溝液混合刺入右側上下頜磨牙頰舌側牙齦，深度4 mm，并注滿齦溝。以自身對側同名牙作為正常對照，禁食水0.5 h。陰性對照組大鼠不做處理。③建模組大鼠給予高糖飲食喂養(yǎng)，陰性對照組大鼠適應性喂養(yǎng)，每日檢查并記錄，持續(xù)14 d。④建模組大鼠第14天出現(xiàn)右側磨牙區(qū)牙齦組織紅腫、觸之出血、磨牙松動、牙周袋逐漸形成并加深、牙根暴露等牙周炎現(xiàn)象，而陰性對照組則沒有明顯變化。⑤第15天將29只大鼠(建模組死亡1只)斷尾取血1 mL，標記為第2組血樣，離心取上清-80 ℃保存。⑥將建模好的25只牙周炎大鼠模型分出19只為藥物實驗組，按600 mg/kg灌胃；另外6只為藥物對照組，給予等體積生理鹽水灌胃，均為每天1次，持續(xù)30 d。⑦陰性對照組4只大鼠，繼續(xù)給予適應性喂養(yǎng)。⑧在第46天第3次對28只大鼠(藥物實驗組死亡1只)心臟取血1 mL，并標記為第3組血樣，離心取上清-80 ℃保存。

1.4 檢測指標：將3組大鼠血清對應標號，酶聯(lián)免疫法檢測血清中BALP、BMP-4。各程序按試劑盒說明書嚴格進行。

2 結果

2.1 大鼠牙槽骨吸收模型的評價：空白對照組大鼠口腔組織表現(xiàn)正常，牙齦無紅腫、無牙周袋、無牙根暴露等。模型組大鼠第14天出現(xiàn)右側磨牙區(qū)牙齦組織紅腫，觸之出血，磨牙松動，牙周袋逐漸形成并加深，牙根暴露現(xiàn)象明顯。

2.2 血清BALP、BMP-4濃度測定：第3組血樣建模組血清標本中BALP以及BMP-4濃度均高于第1、第2組血樣濃度(P<0.05),第3組血樣建模組血清標本中BALP以及BMP-4濃度高于藥物對照組及陰性對照組(P<0.05)，見表1-表2。

表1 3組大鼠血清標本中BALP濃度的比較

表2 各組大鼠血清標本中BMP-4濃度

3 討論

牙周炎是多因素引起的牙周支持組織的慢性炎癥，發(fā)病率高，伴隨其病變發(fā)展可誘發(fā)其他多系統(tǒng)發(fā)生病變，是危害人類健康的重要疾病之一。目前臨床主要以牙周基礎治療為主，它僅能控制病變進展，對牙槽骨骨組織流失不能很好控制及逆轉[7]。因此，對牙周炎治療新策略的研發(fā)利用至關重要。血中骨代謝標志物水平檢測是一種無創(chuàng)快速、靈敏和動態(tài)反映骨轉換變化，對代謝性骨病的診斷、治療以及在評價藥物治療效果中有不可替代的作用[8]。

本研究結果顯示，在大鼠牙周炎模型建立前，所有血清中顯示30只大鼠BALP、BMP-4之間的變化，差異無統(tǒng)計學意義；而第2組血清中顯示BALP、BMP-4在陽性建模組中有較小的變化，但是數(shù)值高低沒有明確的一致性，差異無統(tǒng)計學意義。分析原因可能是BALP、BMP-4在牙周炎模型中，由于在炎癥刺激下，破骨細胞因子增加，而成骨細胞因子處于代償性的對抗狀態(tài)，則表現(xiàn)出少量的改變，再加上個體之間的差異，從而反應出不明確的變化。而陰性對照組與對應的第1組相比沒有變化，結果可以體現(xiàn)出建模的成功及對大鼠BALP、BMP-4的影響。

而在第3組血清檢測中，BALP、BMP-4有明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，陰性對照組與第2組沒有明顯的變化，這充分證明了在甘草水煎液對大鼠牙周炎模型中骨吸收后又增殖的過程發(fā)揮了明確的促進作用。分析可能是甘草有效成分促進BALP及BMP-4的分泌，從而可以誘導未分化的間葉細胞向骨細胞轉化。劉珊等研究顯示，甘草液能抑制炎癥造成的破骨細胞通路的激活，抑制骨的再吸收[9]；李明慧等研究顯示甘草附子湯通過下調破骨細胞組織蛋白酶K(Cath K)的表達來抑制去卵巢大鼠骨組織中成骨細胞I型膠原(Col I)蛋白的降解，增加骨小梁的數(shù)量，改善骨小梁的結構，減低骨的轉換率，從而達到甘草附子湯對絕經后骨質疏松預防的目的[10]。

Mattarello MJ等研究顯示，甘草酸能增加甲狀旁腺激素的水平，從而調整骨代謝[11]；Choi EM等研究顯示，甘草酸可以增加小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1的活性，以及ECM骨信號傳導通路[12]；Sasaki H等研究顯示，甘草液還可以抑制在缺乏IL-10所造成的大鼠牙周炎模型中NF-κb的轉錄活性，從而抑制骨吸收的信號通路[13]；Somjen D等研究顯示甘草液可以促進雌激素的活性，從而促進骨細胞的增殖[14]。通過國內外研究分析，甘草液可以通過多種途徑調整骨代謝，促進骨細胞的增殖。本研究結果與這些結論相一致。

綜上所述,通過本實驗證實甘草水提液能促進大鼠實驗性牙槽骨吸收后骨再生轉化因子BALP、BMP-4的增殖，從而為進一步研制治療牙周炎牙槽骨骨吸收的中藥奠定了理論基礎。甘草到目前已分析出300多種有效成分，具體哪種成分對牙槽骨的細胞增殖有促進作用還有待進一步研究。

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