齊 亮 趙茂程 趙 婕 唐于維一
(1.南京林業(yè)大學機械電子工程學院, 南京 210037; 2.南京師范大學分析測試中心, 南京 210046;3.泰州學院, 泰州 225300; 4.南京工業(yè)職業(yè)技術學院航空工程學院, 南京 210023)
我國豬肉消費量占肉類消費總量的77%[1]。豬肉的品質包括營養(yǎng)成分、風味、嫩度、保水性和新鮮度等要素[2-3],其中,新鮮度是一個重要品質指標。新鮮度測定通常有2種方法,感官評定法和理化分析法。感官評定法主觀因素大,重復性差;理化分析法精確可信,重復性高[4]。理化分析所測定的新鮮度指標包括肉色[5-6]、微生物指標[7-8]、揮發(fā)性鹽基總氮指標[9-10]、K值(品鮮度)[11]、pH值[12-13]和聚胺類化合物質量濃度[14-15]等,其中,基于ATP分解過程的K值被證實是可行的,且越來越受到重視[16-17]。
K值通常采用高效液相色譜分析法(High performance liquid chromatography, HPLC)獲得[18-19],雖然此種理化分析法準確且可信,但是過程耗時、對被測樣品具有破壞性,不能滿足生產(chǎn)和流通環(huán)節(jié)中快速和廣泛性測量要求,用無損檢測方法測定豬肉的K值成為科研工作的一個重要研究熱點。
目前,豬肉新鮮度指標的無損檢測方法有近紅外光譜分析以及可見-近紅外高光譜圖像分析方法,這些方法均基于與豬肉新鮮度相關的化學物質在可見和近紅外波段有特征表達的原理,建立豬肉新鮮度無損檢測的數(shù)學模型,實現(xiàn)了新鮮度的快速和比較準確的測定[20-23]。
但是,利用遠紅外波段光譜數(shù)據(jù)無損檢測豬肉新鮮度的方法卻鮮有報道。太赫茲波(Terahertz, THz)位于毫米波和紅外線之間,屬于遠紅外波段,頻率在0.1~10 THz范圍內[24]。從能量上看,THz波處于電子和光子之間。THz波的多元化特性使得很多化學分子在THz波段下表現(xiàn)出在其他波段下所不具備的分子運動特性[25]。核苷酸類(如ADP、ATP)及其相關物質(如IMP)屬于生物小分子,在THz波段的吸收主要是由于其分子自身的轉動、振動或分子集團的整體振動,有THz波譜特征結構,在THz波段存在多個吸收峰[26-27]。
本文以K值為研究參數(shù),通過探索豬肉新鮮度的THz光譜特性,建立THz光譜數(shù)據(jù)與豬肉K值之間的關系模型,實現(xiàn)對豬肉K值的快速無損檢測,研究一種豬肉新鮮度快速無損檢測方法。
試驗材料為冷鮮豬肉的通脊肉,每天上午從當?shù)爻匈徺I,用冷藏箱運回實驗室后,將豬肉均勻切割成2.5 cm×2.5 cm×0.5 cm的肉片。取樣時避開豬肉的脂肪和結締組織,以防止這些成分對THz檢測結果的干擾。將豬肉樣品用保鮮袋包好并編號后置于4℃冰柜中貯藏待測。連續(xù)采集8 d的肉樣為一個試驗周期。在第8天的下午,完成8個肉樣的THz光譜采集以及K值測定。重復試驗10個周期,得到80個肉樣的光譜數(shù)據(jù)和理化值。
THz檢測設備型號是TAS7500SP (日本Advantest公司),在室溫(25℃)環(huán)境下工作,頻率分辨率為7.6 GHz,檢測頻率范圍是0.2~4 THz,共498個采樣頻率點(波點),樣品譜線經(jīng)過2 048次自動掃描并取平均值后得到。
THz與水有強烈的相互作用,對于富含水的肉樣透射深度只有幾百微米,所以透射模式不適合肉制品新鮮度無損檢測,反射模式也會因為反射波被水吸收而無法檢測。用THz衰減全反射 (Attenuated total reflectance, ATR)檢測模式,可以克服樣品中富含的游離水以及結合水對THz波的強烈吸收,使得樣品表面微米級厚度化學物質的THz特性能夠反映在THz全反射波的光譜里[28]。ATR檢測附件的光路如圖1所示,THz波進入ATR晶體后發(fā)生了全反射,反射后的THz波含有與反射面接觸的樣品表面THz光譜信息。
圖1 ATR附件光路示意圖Fig.1 Schematic diagram of optical path in ATR module1.THz波 2.ATR晶體 3.樣品 4.ATR檢測窗
每個樣品從冰箱取出后,去除包裝,將樣本平整放入ATR檢測窗表面。樣品的上、下2個表面分別采集3次THz光譜數(shù)據(jù),每個樣本能夠獲得6份THz光譜數(shù)據(jù),將6份光譜數(shù)據(jù)取算術平均值,作為該樣本的最終THz光譜數(shù)據(jù)。因為THz光譜儀對溫度和濕度比較敏感,所以光譜采集時,保持實驗室內溫度、濕度基本一致。
豬肉中的一些物質隨保存時間的增加而變質,在宰后的肉品中,三磷酸腺苷(ATP)會自動分解:三磷酸腺苷(ATP)→二磷酸腺苷(ADP)→磷酸腺苷(AMP)→次黃嘌呤核苷酸(IMP)→肌苷酸(HxR)→次黃嘌呤(Hx)。
據(jù)ATP分解過程,測定K值的指標方程為[16]
(1)
式中CATP——樣品中ATP濃度
CADP——樣品中ADP濃度
CAMP——樣品中AMP濃度
CIMP——樣品中IMP濃度
CHxR——樣品中HxR濃度
CHx——樣品中Hx濃度
可見,肉品越是新鮮,K值越低,反之K值越高。采用HPLC方法檢測肉制品中的K值。根據(jù)流動相中ATP分解的關聯(lián)產(chǎn)物(ATP、ADP、AMP、IMP、HxR和Hx)在固定相中的不同流速,將這6種化學組分分離,分別測得這些組分的含量,根據(jù)式(1)計算出被測樣品的K值[19]。本文采集完樣本THz光譜數(shù)據(jù)后立即對同一樣本進行K值測定。
用于K值檢測的樣品前處理過程如下:將被測樣品剁碎成肉泥,從中取(2.00±0.05) g放入50 mL離心管內,加入冷卻后的10%高氯酸溶液20 mL,渦旋振蕩1 min,以8 000 r/min 速度離心10 min,取出上清液。再用5%高氯酸溶液20 mL 重提沉淀物中的待測物,以8 000 r/min 速度離心10 min,合并上清液。用10 mol/L的NaOH溶液調節(jié)提取液pH值近6.0,然后再用1.0 mol/L的NaOH溶液繼續(xù)調節(jié)pH值至6.0~6.4,再用超純水定容至50 mL。用0.45 μm的微孔濾膜過濾, 濾液于4℃下保存, 待測。
HPLC條件如下:Finnigan Surveyor型液相色譜儀(美國Thermo-Fisher公司),AQ-C18型色譜柱(美國Thermo-Fisher公司),流動相為0.05 mol/L的K3PO4緩沖液(pH值6.5),緩沖液用超純水配制,樣品的進樣量1 μL, 流速200 μL/min,檢測波長254 nm。ATP分解的關聯(lián)產(chǎn)物由外標法定量,測定范圍為0~0.5 mmol/L。
試驗中使用的試劑如下:ATP關聯(lián)物(ATP、ADP、AMP、IMP、HxR和Hx)共6種標準品(純度99%以上, 美國Sigma-Aldrich公司);磷酸鉀、氫氧化鈉、高氯酸(分析純, 國藥集團化學試劑有限公司);試驗用水為Millipore Academic型超純水器制備的超純水。
采用HPLC法獲得80個樣本的K值,統(tǒng)計分析結果如表1所示。通過樣本的平均值可以看出,隨著儲存時間的增加,新鮮度不斷降低,樣本的K值逐步增加,但增加量不是固定的。其中, 5~6 d、6~7 d的增加量相對較大,說明在上述存儲周期內,肉樣的品質變化程度較大;感官評價也證實肉樣在6~7 d存儲周期內,觸摸較黏,有明顯的酸味,因此可推測肉樣在此周期內新鮮度顯著下降。本試驗所有樣本的K值覆蓋了豬肉的不同新鮮度,覆蓋范圍廣,有助于使本文最終建立的THz光譜預測K值模型有較好的魯棒性。
表1 HPLC測得的K值Tab.1 K values measured by HPLC
80個樣本被隨機分為54個校正集和26個預測集,個數(shù)比大致為2∶1。其中校正集用于建立THz光譜預測K值的數(shù)學模型;預測集用來檢驗所建立的模型預測未知樣本K值的準確性。通過表2可以看出,校正集、預測集和樣本總集合的K值范圍基本相同,平均值和標準差也沒有明顯區(qū)別,因此校正集和預測集的樣本分割是合適的。
表2 校正集與預測集的K值統(tǒng)計信息Tab.2 Statistic information of all samples in calibrationand prediction sets
肉樣的同一表面在相同的測試條件下連續(xù)測量6次,獲得6條THz光譜,理論上這6條光譜應該完全重合,但由于儀器的噪聲及測試誤差的影響,連續(xù)重復測得的6條光譜不可能完全重合。為了評價光譜質量,可以計算同一樣品表面連續(xù)重復測試ns次獲得的ns條光譜的標準方差光譜(Standard variance spectrum of repeat spectral, SVSRS),SVSRS值越小,說明光譜質量越好[29],公式為
(2)
式中xkj——第k次測量樣本在波點j處的ATR反射率
Sj——波點j處的SVSRS值
圖2a是某個肉樣表面在0.2~4 THz的6次THz光譜,圖2b是該光譜對應的SVSRS,從圖中可以看出在2~4 THz的SVSRS值明顯增高,重復性差。故選擇0.2~2 THz作為建模的光譜頻段。圖3a是80個樣本在0.2~2 THz區(qū)域的THz光譜譜線,可以看出,不同豬肉樣本的原始光譜強度有很大的差異。光譜的差異不僅包含了樣本成分的差異,還包括測量誤差、基線漂移和背景噪聲。為了消除干擾信息,除了盡可能保持試驗環(huán)境因素一致外,還須對光譜數(shù)據(jù)進行預處理,以減弱或去除各種干擾因素。
圖2 THz光譜波段選擇Fig.2 Scope selection of THz spectra
圖3 THz光譜預處理Fig.3 Preprocessing of THz spectra
本文采用一階導數(shù)(First order derivative,F(xiàn)D)預處理光譜數(shù)據(jù),一階導數(shù)能夠減少基線偏移、漂移和背景干擾造成的數(shù)據(jù)偏差,使得與新鮮度密切相關的光譜特性變得更為顯著[30-31]。由于導數(shù)計算會增加噪聲,故導數(shù)預處理之后采用Savitzky-Golay (SG)多項式平滑光譜[32]。在求導過程中,差分寬度選擇十分重要:寬度過小,噪聲會過大,影響所建模型的質量;寬度過大,平滑過度,會失去大量的細節(jié)信息[33]。圖3b為經(jīng)過15點一階求導和SG平滑后得到的一階導數(shù)光譜圖。
由上文論述可知,豬肉腐敗過程中會使K值相關的ATP關聯(lián)產(chǎn)物的含量發(fā)生變化,而這些生物分子對THz波具有靈敏的光譜響應,THz光譜能夠反映出這些生物分子含量的變化。因此THz光譜數(shù)據(jù)與豬肉的新鮮度之間存在一種間接的關聯(lián)性。本文使用線性算法——主成分回歸(Principal components regression,PCR)和偏最小二乘回歸(Partial least squares regression,PLSR)以及非線性算法——反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡回歸(Back propagation artificial neural network, BP-ANN)分別驗證這種關聯(lián)性,并試圖找到一種THz光譜預測豬肉K值的數(shù)學模型。評價模型質量的指標有校正集相關系數(shù)RC、校正集均方根誤差EC、預測集相關系數(shù)RP和預測集均方根誤差EP[34]。相關系數(shù)RC和RP越大,EC和EP越小,則模型的預測能力越好。本文使用Matlab R2009b(美國Mathworks 公司)軟件對光譜數(shù)據(jù)進行計算與建模。
2.3.1主成分回歸PCR預測模型
本試驗中的每一條光譜都含有250個波點,光譜的波點數(shù)遠大于樣本數(shù),如果直接用于回歸分析,會出現(xiàn)過擬合,降低模型的預測精度和穩(wěn)定性。同時光譜波點的數(shù)據(jù)間存在較高的共線性和相關性,也會使得回歸模型的結果產(chǎn)生失真??梢酝ㄟ^主成分分析法(Principal component analysis,PCA)對光譜信息進行壓縮,通過少數(shù)幾個主成分的得分來近似反映原光譜數(shù)據(jù),消除光譜數(shù)據(jù)點的信息冗余和相關性[35]。
本文用PCA法將預處理后的光譜矩陣進行主成分分解,取累積貢獻率達到95%的主成分集合作為預測模型的輸入。根據(jù)預測模型達到最高RP和最低EP時選擇光譜預處理的差分寬度。
模型計算表明當一階差分寬度為15時,累積貢獻率95%的主成分集合數(shù)為26,PCR的預測性能最佳(RP=0.63,EP=16.78%),如圖4a所示 。圖4b是PCR模型在此參數(shù)條件下的K值預測散點圖。
圖4 PCR模型的預測結果Fig.4 Results of PCR model
2.3.2PLSR預測模型
PLSR不僅與PCR一樣都對光譜矩陣進行主成分分解,還對參考變量(K值)進行主成分分解,并且在迭代分解時考慮兩者的線性相關性,迭代分解后的潛變量(Latent variable, LV)能夠最大程度反映光譜矩陣的信息,并使得光譜矩陣和參考變量的相關性達到最大化。潛變量數(shù)采用留一交叉驗證法選取,即選取交叉驗證均方根誤差(Root mean square error of cross validation, RMSECV)值最小時的潛變量數(shù)[36]。根據(jù)這一原則,考察預測模型在預處理差分寬度3~47范圍內,潛變量數(shù)在1~20的范圍內,RMSECV的數(shù)值變化情況,如圖5a所示??梢钥闯觯A處理差分寬度為31且潛變量數(shù)是5時,RMSECV數(shù)值最小,為19.12%,PLSR的預測性能最佳。圖5b是PLSR模型在此參數(shù)條件下的K值預測散點圖。
圖5 PLSR模型的預測結果Fig.5 Results of PLSR model
2.3.3BP-ANN預測模型
BP-ANN能夠模仿延伸人腦的認知功能探索并構建輸入信號與輸出信號之間的復雜聯(lián)系。BP-ANN一般使用多層前饋神經(jīng)網(wǎng)絡。本文使用的神經(jīng)網(wǎng)絡拓撲結構分為3層:輸入層、單隱含層和輸出層。為了降低神經(jīng)網(wǎng)絡訓練的復雜度,采用PCA方法將預處理后的光譜矩陣進行主成分分解,取累積貢獻率達到95%的主成分集合作為神經(jīng)網(wǎng)絡的輸入,輸出層為一個節(jié)點,即預測K值。單隱含層的節(jié)點數(shù)由經(jīng)驗公式得出[37],即
(3)
式中mh——隱含層節(jié)點數(shù)
mi——輸入層節(jié)點數(shù)
mo——輸出層節(jié)點數(shù)
a——1~10范圍內的常數(shù)
據(jù)此隱含層節(jié)點數(shù)范圍選擇為4~17。訓練神經(jīng)網(wǎng)絡前,輸入的光譜矩陣被歸一化至-1~1的范圍內,實測K值被歸一化至0~1的范圍內。隱含層的傳遞函數(shù)是“l(fā)ogsig”(S型對數(shù)函數(shù)),輸出層的轉移函數(shù)是“tansig”(雙曲正切S型傳遞函數(shù)),BP網(wǎng)絡的訓練函數(shù)為trainlm(Levenberg-Marquardt 訓練函數(shù))。因為隱含層的節(jié)點數(shù)會影響神經(jīng)網(wǎng)絡預測的性能,所以采用留一交叉驗證法選取,即選取RMSECV值最小時的節(jié)點數(shù)[38]。根據(jù)這一原則,考察預測模型在預處理差分寬度3~25范圍內,隱含層的節(jié)點數(shù)在4~17范圍內,RMSECV的數(shù)值變化情況,如圖6a所示??梢钥闯?,預處理差分寬度為13且隱含層節(jié)點數(shù)是9時,RMSECV數(shù)值最小,為18.1%,BP-ANN模型的預測性能最佳。圖6b是BP-ANN模型在此參數(shù)條件下的K值預測散點圖。
圖6 BP-ANN模型的預測結果Fig.6 Results of BP-ANN model
表3系統(tǒng)比較PCR、PLSR、BP-ANN 3種THz光譜預測K值數(shù)學模型的性能,可以看出,非線性模型BP-ANN的預測性能明顯優(yōu)于線性模型PCR和PLSR。其原因可以通過以下方面來解釋:
表3 3種K值預測模型的回歸結果比較Tab.3 Regression result comparison of K value forthree models
(1)在線性模型中,PLSR模型的預測結果劣于PCR模型的預測結果??赡艿脑蚴牵琍LSR模型在校正集的建模擬合過程中過多地考慮了光譜矩陣和參考變量的相關性,導致校正集建模出現(xiàn)了過擬合,所建模型在預測集中的預測性能出現(xiàn)了明顯下降。
(2)非線性模型BP-ANN預測結果最優(yōu)??赡艿脑蚴?,K值由ATP的6種關聯(lián)物含量的比值決定,這些分子物質的含量與THz光譜中的譜線數(shù)據(jù)是非線性關系,而且各分子物質在THz光譜中也是互相重疊的[27]。所以非線性模型能夠在建模過程中通過自學習和自調整方法擬合非線性關系,所建立的預測模型會比線性模型更優(yōu)秀。通過較優(yōu)模型可以進一步推斷,光譜數(shù)據(jù)預處理的差分寬度選擇13(BP-ANN模型)或者15(PCR模型)是合適的,差分寬度過小或者過大都會降低模型的預測性能。
(3)非線性模型BP-ANN有進一步完善的空間。樣品成分復雜,吸收光譜中未見有明顯的吸收峰或者特征波段,可以設計更優(yōu)算法,濾除與新鮮度無關的物質對THz光譜的影響,從復雜成分的THz光譜中提取與K值相關度更大的特征波段,研究出更適合K值和THz光譜的復雜非線性關系模型,進一步提高預測精度。
采用ATR全反射模式,在0.2~2 THz范圍內獲取冷鮮豬瘦肉表面的THz光譜數(shù)據(jù),經(jīng)一階微分和SG平滑濾波處理后構建數(shù)學模型,快速無損檢測豬肉K值,以評價豬肉新鮮度。3種預測模型PCR、PLSR、BP-ANN的比較研究表明,相比線性PCR、PLSR模型,盡管非線性BP-ANN模型有進一步完善的空間,但能更好地擬合THz光譜數(shù)據(jù)和新鮮度K值之間的復雜非線性關系,最適合于K值預測,其預測相關系數(shù)達到0.75,預測集均方根誤差達到14.36%?;谙嗤腡Hz檢測原理,THz光譜分析法還應能無損檢測其他肉類(如雞肉、牛肉、魚肉等)的K值。此項研究為基于此方法開發(fā)設計便攜式檢測設備提供了理論基礎。
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