侯 越，包鴻慧

（黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319）

0 引言

多糖也稱多聚糖，是10個以上單糖殘基用糖苷鍵相連而成的聚合體，是構成生命的四大基本物質之一[1]。在自然界中90%以上的碳水化合物都是以多糖形式存在的，它直接參與生物體的基本代謝過程，對生物體的代謝過程產生積極影響。中外醫(yī)藥學家現已證實，多糖及多糖類產品對慢性疾病有著顯著的食療效果。隨著生活水平的提高和人口老齡化時代的到來，人們將更加關注保健與養(yǎng)生，而多糖類的廣泛性與顯著的生物學活性，正好契合這種需要。而且，研究發(fā)現多糖對人體無毒副作用，被譽為“21世紀”人類醫(yī)學保健領域的救星。因其特殊的生理作用，多糖現已成為國內外眾多學科領域研究的熱點之一。但截至目前，人們對多糖的研究還遠遠不如蛋白質和核酸那樣深入。

榛蘑，學名蜜環(huán)菌，為白蘑科植物蜜環(huán)菌的子實體，是我國一種十分重要的藥食兼用真菌。榛蘑營養(yǎng)豐富，含有人體必需的多種氨基酸和維生素。現代藥理學研究表明，榛蘑多糖具有抗輻射、促進造血、抑制腫瘤生長和調節(jié)免疫等藥理作用[2]，相關研究表明，在多糖的提取過程中，提取液中的部分多糖會與一些游離蛋白質共存，并形成糖蛋白復合物，使得蛋白質難以脫除。而脫除蛋白是多糖純化的一個重要步驟，純化程度對研究多糖的生物功能性尤為重要，如何在盡可能多地保留多糖的有效成分的前提下將蛋白質除去，是多糖純化試驗的關鍵部分。

1 脫蛋白的方法

應用蛋白質沉淀、多糖不沉淀的原理，可將多糖提取液中的蛋白質脫去。主要采用Sevage法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法等方法[3]，在多糖的純化除雜中，將結合成糖蛋白形式的結構復雜、組成多樣的蛋白質和多糖分離開來。

1.1 Sevage法

根據氯仿等有機溶劑會導致蛋白質變性的特點，將多糖提取液與Sevage試劑[氯仿∶正丁醇=5∶1（V/V）]按照 5∶1的比例混勻后，劇烈振搖 20～30 min，蛋白質結構遭到破壞，變性形成凝膠，變性的蛋白質存在于水層和有機溶劑層分層交界處，經離心可除去[4]。張立娟等人[5]通過研究Sevage試劑配比（氯仿∶正丁醇）、多糖提取液與Sevage試劑的體積比對多糖含量及蛋白脫除率的影響，通過試驗得出Sevage試劑配比（氯仿∶正丁醇） 5∶1，多糖提取液與Sevage試劑的體積比4∶1為最優(yōu)配比，由此提取條件得出的多糖含量42.39%，蛋白質的脫除率82.07%。

此方法條件溫和，雖不會引起多糖的變性，但只局限于將多糖提取液中游離的蛋白質去除，不適于脫除與多糖緊密結合的蛋白質，且需重復多次，效率也低，同時由于試驗次數過多，也會造成少量的多糖流失。在試驗操作過程中可以配合加入一些蛋白質水解酶，使脫除蛋白的效果更佳。

1.2 三氯乙酸法

三氯乙酸除蛋白的原理是利用蛋白質會在有機酸的作用下發(fā)生變性，形成不可逆的沉淀這一特性除去提取液中的蛋白質，通常是于低溫條件下將5%等體積的三氯乙酸溶液滴加至多糖提取液中，充分混勻后，于4℃條件下靜置過夜，將膠狀沉淀通過離心后除去。反復多次試驗至不再渾濁，最終得到除去蛋白的多糖溶液[6]。三氯乙酸體積分數越大，除蛋白質效果越好，但對多糖的影響也越大，可能是三氯乙酸對多糖結構具有破壞作用，使多糖降解，結構受到影響，經該法脫蛋白的多糖復溶性變差，而且這種破壞作用隨著三氯乙酸體積分數增大而增強[7]。趙師師等人[8]在三氯乙酸法脫除石榴皮多糖蛋白質試驗中采用三氯乙酸體積分數5%，振搖時間10 min，脫蛋白次數3次，在此條件下石榴皮多糖中蛋白率脫除率達89.0%，多糖損失率為8.4%。陳湘[9]在黃蘑除蛋白試驗中直接向多糖溶液中加入三氯乙酸晶體，通過不同TCA用量考查其吸光度和多糖質量分數后發(fā)現，粗多糖與三氯乙酸質量比為1∶6時除蛋白效果較好。

1.3 三氟三氯乙烷法

三氟三氯乙烷法是將等體積的三氟三氯乙烷加入到多糖提取液中，混合均勻后于低溫下攪拌10 min，水層經離心后分離，重復處理2次，即可得到除去蛋白質的多糖溶液[10]。楊景明等人[11]將制備的防風粗多糖用水溶解，將等體積的三氟三氯乙烷加入到多糖溶液中，低溫攪拌10 min，離心后分取水層，再用上述溶劑處理2次，得到無蛋白質的防風多糖溶液。三氟三氯乙烷法的優(yōu)點是蛋白去除率較高，但由于三氟三氯乙烷沸點較低、易揮發(fā)，不宜大量應用，同時攪拌時應注意在低溫下進行。

1.4 鹽酸法

鹽酸法就是利用蛋白質在等電點時溶解度最低的這一特性，使多糖中的蛋白在酸性溶液中沉淀，此方法是為了降低多糖在酸性條件下的分解[12]。張海燕[13]在山藥多糖除蛋白的相關試驗中通過測定其蛋白質含量和多糖含量，綜合蛋白質脫除率和多糖保留率，確定鹽酸法除蛋白的最佳條件為pH值2.0，此時脫蛋白率為93.95%，多糖保留率為67.74%。鹽酸脫蛋白法的優(yōu)點是高效，但因其需要嚴格的試驗條件，如條件不足則會使得多糖被水解，從造成損失。

1.5 酒精變性法

酒精變性法的原理是利用蛋白質經有機溶劑變性處理后難與水互溶，而多糖沉淀后可復溶于水這一特點將蛋白去除。董宏平等人[14]在對水花微囊藻多糖除蛋白試驗中采用酒精變性法除蛋白。試驗結果表明，酒精可以有效去除蛋白，多糖提取液的蛋白去除量可達64.8%～75.8%。該法的優(yōu)點是操作簡便、試劑無毒無污染。但會降低多糖的回收率，原因是部分多糖會與蛋白結合，導致復溶性變差，難以回收。同時，在大量提取時會消耗大量的乙醇，成本較高，不宜采用此方法。

2 結語

每一種脫蛋白的方法，除蛋白效率都較高，但卻有各自的缺點。Sevage法作為最常用的除蛋白方法，會消耗較多有機溶劑，容易造成多糖的損失，應用時應著重考慮去蛋白的次數來減少損耗。三氯乙酸法脫蛋白后多糖的復溶性明顯減弱。三氟三氯乙烷沸點較低、易揮發(fā)，不宜大量應用。鹽酸法脫蛋白率雖然高，但多糖的損失率也較高。酒精變性法雖可獲得較高的蛋白去除率且操作簡便，但會降低多糖的回收率，原因是部分多糖會與蛋白結合，導致復溶性變差，難以回收。除以上幾種常用方法外，近年來人們還在不斷探索其他有效的脫蛋白法，如氫氧化鈉法、氯化鈣法、反復凍融法、陰離子交換樹脂法、徑向流動色譜法、蛋白酶法等[15]。在進行榛蘑脫蛋白純化試驗中可以選擇不同的方法進行聯用，以此達到最佳的脫蛋白效果。