鄒 奕 ，吳則東 ，3，興 旺 ，3，邳 植 ，崔 平 *

（1.黑龍江大學農(nóng)作物研究院/中國農(nóng)業(yè)科學院甜菜研究所，哈爾濱150080；2.黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱150080；3.中國農(nóng)業(yè)科學院北方糖料作物資源與利用重點開放實驗室，哈爾濱150080）

甜菜分為野生種和栽培種，栽培種又分為4個變種：葉用甜菜、糖用甜菜、食用甜菜和飼用甜菜。甜菜分為3個亞種，其中有兩個是野生亞種，而全部的栽培種屬于Beta vulgaris subsp.vulgaris亞種[1-2]。我國甜菜品種主要來自法國、丹麥、德國、美國等國家，有的甜菜品種直接應用到生產(chǎn)中，有的品種作為父母本材料應用到培育甜菜新品種（系）中。種質資源的遺傳多樣性是育種的基礎也是引種栽培和資源保護的基礎，遺傳多樣性研究對于選擇具有較強組合能力的親本是非常重要的，在雜交時，可以增加獲得優(yōu)良基因型的機會；植物材料的遺傳多樣性評價是鑒定、保存遺傳資源和設計育種方案的第一步[3]。甜菜屬藜科甜菜屬，是世界上最重要的糖料作物之一。研究甜菜種質資源的遺傳多樣性，能夠幫助我們分析種質間親緣關系的遺傳組成，對拓展甜菜種質基礎、發(fā)掘和利用優(yōu)質基因進行新品種培育具有重要意義。

1 甜菜的遺傳多樣性研究

遺傳多樣性通常指物種內不同種群之間或種群內個體間的遺傳變異。遺傳多樣性的表現(xiàn)是多層次的，表現(xiàn)出個體水平、細胞水平、染色體結構及功能的多樣性。在分子水平上，其特征在于生物大分子的多樣性，例如核酸、蛋白質和多糖。生物的進化造成生物分布與適應性差異，遺傳表達為遺傳多樣性。目前，我們主要從形態(tài)學水平，細胞學水平，生化水平和分子水平研究遺傳多樣性[4]。

1.1 形態(tài)學水平

形態(tài)標記是在植物生長發(fā)育期間可看到的形態(tài)特征，是顯示遺傳多態(tài)性的外觀特征。

興旺等[5-6]研究了來自不同國家甜菜種質資源的不同形態(tài)形狀的遺傳多樣性。結果表明，不同國家的種質資源遺傳多樣性豐富，充分了解了甜菜種質資源葉部性狀遺傳多樣性地理分布特點和種質資源種群間的遺傳關系，對于鑒別特異種質，挖掘優(yōu)異種質材料具有現(xiàn)實意義，并篩選出了部分可用于育種的優(yōu)質親本。趙尚敏等[7]采取聚類分析的方法對甜菜抗叢根病種質資源進行遺傳多樣性劃分，對形態(tài)學指標進行主成分分析后，將59份甜菜種質資源材料分為六大類，供試材料表型遺傳上存在較大差異，為育種選種提供了有價值的信息。M Saccomani等[8]對18個甜菜基因型研究發(fā)現(xiàn)根長、根表面、根頭量、葡萄糖和果糖含量有顯著的遺傳差異，這些性狀與根產(chǎn)和產(chǎn)糖量顯著相關。這些結果表明根形態(tài)、生理性狀與其生產(chǎn)力的關系存在密切關聯(lián)。這些在整個根系層面的協(xié)調行動有助于解釋植物如何適應多種環(huán)境壓力。Stevanato等[9]通過根系性狀的評估探索亞得里亞海沿岸甜菜種質遺傳多樣性，在具有理想根性狀的甜菜種質中，有4份材料（B.vulgaris L.ssp.vulgaris）對營養(yǎng)脅迫有高耐受性。植物育種中形態(tài)標記雖相對直觀，但無法準確地了解種群的遺傳變異[10]。

1.2 細胞學水平

細胞學標記即植物細胞染色體的變異。包括染色體核型和帶型的變化[11]。利用細胞學標記研究甜菜遺傳多樣性的研究在上世紀60~80年代較多，近年來比較少。王華忠等[12]研究單胚甜菜細胞質雄性不育系和保持系，發(fā)現(xiàn)形態(tài)學和細胞學上存在較大差異，將敗育初期確定在四分體時期的絨氈層細胞與中層脫離開始,與以往的研究者認為敗育初期在四分體時期以后的看法有所不同。

1.3 生化水平

生化標記主要包括貯藏蛋白和同工酶標記，它們是基因表達的直接產(chǎn)物，結構多樣性可間接反映生物DNA組成和生物遺傳的差異與多樣性。它打破了形態(tài)學和細胞學標記直接使用整個樣本作為研究材料的方式，并且?guī)缀醪灰蕾囉诃h(huán)境[13]。但是生化標記在甜菜中的應用也不多。

張輝等[14]分析了航天衛(wèi)星搭載的葉叢快速增長期的一年生 SP3、盛花期和抽薹期的二年生SP3甜菜的SOD、CAT、POD酶活性及同工酶譜。結果表明，各品系變異程度不同，二倍體材料的變異率明顯高于四倍體和單胚材料。H Wagner等[15]也利用甜菜的同工酶標記與形態(tài)標記的連鎖關系來評估材料之間的遺傳關系。

1.4 DNA水平

分子標記指能反映個體或種群基因組中某種差異的DNA片段，直接反映基因組DNA之間的差異[7]。遺傳多樣性和種質結構的評估對于有效組織育種材料以及利用遺傳資源改良作物是必不可少的[16]。分子標記反映了DNA水平上基因型之間存在的實際遺傳變異水平，并因此提供了比表型和譜系信息更準確的評價。

1.4.1 RAPD標記技術 RAPD技術可以在DNA分子水平上檢測全基因組多態(tài)性，無需任何分子生物學研究，為確定品種和品系之間的遺傳關系提供統(tǒng)計分析的基礎。目前，該技術已廣泛應用于各種動植物的遺傳多樣性研究，并在甜菜研究中發(fā)揮了一定的作用[17-18]。

張子義等[17]和張福順等[18]利用RAPD技術對不同甜菜品種進行分析比較，結果表明甜菜的遺傳資源較為豐富，且不同國家的品種親緣關系相對較遠，應加強種質收集，為雜交育種創(chuàng)造有利條件。Shen等[19]首次采用RAPD技術對一年生野生甜菜的遺傳多樣性進行檢測并對其間的親緣關系進行了劃分。Saclain等[20]用6個RAPD隨機引物探究了11個甜菜品種的遺傳變異和親緣關系，共擴增63個DNA片段，其中43個（68.25%）有多態(tài)性，遺傳變異較遠的相關品種可以選擇用于將來的育種計劃。V Izzatullayeva等[21]使用RAPD比較分析42個甜菜種質的遺傳變異。共使用24個多態(tài)性引物（12個RAPD和12個ISSR）。RAPD引物產(chǎn)生204個擴增產(chǎn)物，ISSR引物產(chǎn)生178個擴增片段，其中190個和173個分別為多態(tài)性引物。ISSR標記的平均多態(tài)性水平（97.2%）高于RAPD引物（93.0%）。類似的研究還有很多，這些研究充分地證明了RAPD分子標記技術在檢測遺傳多樣性及親緣關系分析中是很有潛力的。

1.4.2 SSR標記技術 由于其遺傳共顯性和技術簡單的特點，SSR技術被廣泛用于甜菜遺傳多樣性的分析，并且是目前最常用的分子標記技術之一。

王華忠等[22]結合SRAP和SSR兩種分子標記，分析了甜菜單胚雄性不育系及保持系的遺傳多樣性。結果表明，不同甜菜品種的異質性較高，國內外材料的遺傳基礎不同。然而，用于生產(chǎn)的甜菜品種具有較近的親緣關系和較窄的遺傳基礎。楊文柱[23]優(yōu)化了甜菜分子標記技術體系，通過SSR分子標記技術，發(fā)現(xiàn)57種甜菜試驗材料具有豐富的遺傳多樣性。 根據(jù)引物檢測到的甜菜材料的遺傳多樣性圖譜將57種甜菜材料聚成兩類。 第一類是與抗病性密切相關的基因型材料，第二類是與含糖和產(chǎn)量密切相關的基因型材料。P.Stevanato等[9]用44個多態(tài)等位基因的21個SSR標記對亞得里亞海沿岸的39種沿海甜菜遺傳多樣性進行了評價，沿海甜菜主要分成兩個類群：西部和東亞得里亞海沿岸群，后者表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。JLi等[24]用23個SSR標記對來自種子和花粉親本雜種優(yōu)勢基因庫的111和178個自交系進行了基因分型，在整個種質中檢測到兩個不同的亞組。Ta?ki-Ajdukovic K等[25]用26個SSR引物對來自12個二倍體甜菜授粉者（花粉親本）和兩個細胞質雄性不育系（CMS）共140個個體樣本的遺傳多樣性進行了研究。結果：共獲得129個等位基因，每個SSR平均3.2個等位基因，雜合度為0.00～0.87（平均0.30），77.34%的總遺傳變異歸因于群體內的變異。該方法可提高授粉系作為合適親本的選擇效率。SSrivastava等[26]用14個含二核苷酸的SSR引物擴增了13個基因型的基因組DNA，獲得243個擴增子，屬于88個等位基因，分子量為124~1222 bp，平均為17.36個擴增子/引物，多態(tài)信息含量（PIC）=0.625～0.851。UPGMA樹狀圖將這些基因型分類兩個主要群、共5個叢。共表型系數(shù)（r=0.96）證明這些SSR標記能有效地分析甜菜基因型間的遺傳關系。

1.4.3 SRAP標記技術 序列相關擴增多態(tài)性 （SRAP）技術是一種基于PCR擴增技術的新型高效PCR技術。SRAP標記技術也發(fā)展得比較成熟，我國學者在甜菜上的應用報道較多，如張輝[14]、王華忠[22]、李博[27]。王茂芊等[28-30]利用SRAP對東北、華北、西北地區(qū)的甜菜品系進行了遺傳多樣性研究。王茂芊等[31-32]用SRAP引物組合進一步鑒定分析了11份抗根腐病的優(yōu)良甜菜品種和25份抗褐斑病性較好的甜菜品種，結果表明，平均多態(tài)性比分別為76.5%和64.4%，遺傳距離分別為0.5057和0.4670，遺傳相似系數(shù)分別為0.6031和0.6269，兩種材料的聚類分析均分為3個類群。Nagl N等[33]介紹了開發(fā)快速和廉價的RAPD和SRAP標記方法的結果，并討論了它們在鑒定與抗甜菜胞囊線蟲抗性基因相關標記方面的潛在用途。

1.4.4 ISSR標記技術 ISSR標記技術試驗操作簡單、快速、高效，重復序列和錨定堿基的選擇是隨機的，無需繁瑣地構建基因文庫、雜交和同位素顯示等程序，無需掌握靶標序列的背景信息，無需活材料和無組織器官特異性，從而降低了技術難度和實驗成本，能實現(xiàn)全基因組無編碼取樣[34]。

劉華君等、傅增娟等、劉巧紅等使用ISSR標記進行甜菜遺傳多樣性評價研究[35]，其中，20份德國和瑞士的甜菜種質資源中，獲得30條多態(tài)性條帶，遺傳相似系數(shù)為0.4615～0.9231，引物的多態(tài)信息含量（PIC）為0.6273～0.8360；僅利用1條ISSR引物，鑒定了33個甜菜種質資源中的10份；用兩個ISSR引物，鑒定了10份來源不同的甜菜品種。H Keykhosravi[3]采用20個ISSR引物研究了甜菜20個世代的遺傳多樣性。結果表明，基因型UBC 853的PIC最高（0.38）、UBC 847的最低（0.13）；UBC 830位點的物種多樣性指數(shù)最高(4.32)、UBC 847的最低 （0.58）。聚類分析將甜菜基因型劃分為4個主要類群。前3個主成分分別為總變異的72.67%、5.99%和4.05%，3個主成分占總變異的82.72%，表明ISSR標記在全基因組中分布良好?；诘谝恢鞒煞值奶鸩嘶蛐头诸惥哂邢嗨菩院筒町愋?。本研究結果可用于甜菜育種計劃。

Izzatullayeva V等[21]發(fā)現(xiàn)ISSR引物比RAPD更適合甜菜的遺傳多樣性分析。Srivastava S等[36]使用28個RAPD和4個ISSR引物進行分析，獲得具有162~2862 bp的327個RAPD標記（11.67/引物）和160~1884 bp的39個ISSR標記 （9.75/引物）的高度多態(tài)性條帶。RAPD和ISSR引物PIC的平均值分別為0.41和0.44。RAPD與ISSR遺傳相似度間存在顯著相關性 （r=0.908），但同工酶與RAPD和ISSR的相關性較低?；赗APD（0.27）和ISSR（0.35）的平均遺傳相似性比同工酶（0.726）低得多，說明基于DNA的標記具有檢測群體中高度多態(tài)性的能力。A Litwiniec等[37]采用RAPD、ISSR分子標記技術評價野生甜菜和栽培甜菜尤其是Beta vulgaris遺傳多樣性的程度，目的是確定在叢根病環(huán)境抗性背景下，在不同材料群中所選擇的分子標記的潛在有用性和一致性。結果表明，栽培型品種間群體分化值和距離值相對高于野生型。此外，品種多樣性成分在種群水平受影響高于總體水平。研究結果揭示了栽培種上存在的預期遺傳瓶頸，與野生抗病源相比，現(xiàn)代品種叢根病抗性的遺傳決定因素之間存在顯著性差異。

1.4.5 SNP標記技術 目前單核苷酸多態(tài)性（SNP）在甜菜上的應用具有廣闊的發(fā)展空間。Simko I等[38]采用702個多樣性陣列技術 （DArT）、34個SNP和30個SSR標記對5個種子公司的54份二倍體甜菜（Beta vulgaris L.ssp.vulgaris）雜交種進行基因分型。對SSR和SNP數(shù)據(jù)集的分析表明，部分雜交品種有共同的（或非常密切的）親本。3個標記系統(tǒng)的比較顯示，分析所需的位點數(shù)目有很大的差異。品種聚類要求基因型多樣性檢測所需的SSR標記為1.8～2×SSR，3～4.5×SNP，為4.8×DArT標記。不同標記系統(tǒng)的位點成功率，SSR標記最高，DArT標記最低。一般需要1.4~3×SNP，4.9~13.3×SSR，才能達到100%的成功率。然而，僅使用多態(tài)性較高的DArT標記，可使分析所需的DArT位點數(shù)減少38%～61%。B Mangin等[39]用320和769個SNP分析了2035份世界甜菜種質和1338份甜菜優(yōu)良品系的遺傳關系和連鎖不平衡，用4種不同的方法對種群結構進行了分析。在世界種組中，有3種方法給出了非常一致的種群結構圖。飼用甜菜和糖甜菜被分為一組，從觀賞甜菜和沿海甜菜中分離出來，很好地反映了甜菜馴化的起源。然而，聚類優(yōu)良品系組結構不太穩(wěn)定，可能是育種中基因高度混合所致。種群變化進程和交配系統(tǒng)被認為是影響植物種內遺傳多樣性的主要因素。PTouzet等[40]對地理分布和交配系統(tǒng)不同的Beta macrocarpa、Beta patula、Beta vulgaris maritima和B.v.adanensis進行了葉綠體和核序列的核苷酸多樣性研究。通過系統(tǒng)發(fā)育和多元分析來評估它們之間的遺傳關系，將它們的遺傳多樣性與其交配系統(tǒng)聯(lián)系起來，Beta macrocarpa主要為二倍體，但在加那利群島和葡萄牙卻為四倍體，因此要重新考慮它們的倍性狀況和加那利群島的Beta macrocarpa起源。

1.4.6 其他標記技術 其他主要的分子標記目前也已被應用到甜菜研究中。孟祥雯等[41]用cDNA-AFLP分子標記對不育系及保持系甜菜花蕾進行基因多態(tài)性分析，經(jīng)篩選、驗證后得到4個陽性差異片段。這些片段可作為甜菜Owen型不育系及保持系快速鑒定的依據(jù)，對縮短甜菜育種年限，加快育種進程具有重要意義。

2 甜菜種質資源遺傳多樣性研究方向的展望

甜菜遺傳多樣性研究方法發(fā)展歷程表明，DNA水平的分子標記技術具有準確、高效、成本低的優(yōu)點，目前已逐漸變?yōu)橹髁?。而在眾多分子標記技術中，RAPD、SSR、ISSR、SRAP等技術目前已非常常用且成熟。在甜菜的研究中，SSR標記仍是目前的主流，但應認識到，SNP標記具有全基因組覆蓋、高通量、位點特異等SSR不具有的優(yōu)點且成本正在降低，因此我們應重視SNP標記[42]。同時，現(xiàn)在有越來越多的作物的全基因組測序已經(jīng)完成，并且高通量重測序技術也日益普及，我們也應在全基因組學的水平開展對甜菜的遺傳多樣性的研究，這方面的技術在國外已相當成熟，值得我們借鑒，如Jessen V[43]等人就利用了基因組組裝技術分析了栽培木薯之間的關系。我們應在積極運用新技術的基礎上更好地開展甜菜種質資源遺傳多樣性的研究。