尤久琳， 陳姝娜， 高 斌， 解婷婷綜述， 馮加純， 馬 迪審校

越來(lái)越多的研究關(guān)注缺血處理(ischemic conditioning)對(duì)急性腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。根據(jù)處理的時(shí)間不同，缺血處理分為缺血前處理(ischemic pre-conditioning)、缺血過(guò)程中處理(ischemic per-conditining)和缺血后處理(ischemic post-conditioning)，分別在腦缺血事件發(fā)生前、發(fā)生過(guò)程中或發(fā)生后對(duì)腦組織進(jìn)行一系列短暫的阻斷血流/再灌注，以激活多種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，減輕腦組織損傷。由于其臨床應(yīng)用受到對(duì)腦實(shí)施額外缺血風(fēng)險(xiǎn)的限制，近些年來(lái)，缺血處理的概念擴(kuò)大至遠(yuǎn)隔缺血處理(remote ischemic conditioning，RIC)，通過(guò)袖帶加壓阻斷肢體血流之后再?gòu)?fù)流，可以反復(fù)多個(gè)循環(huán)，也能發(fā)揮對(duì)腦組織的保護(hù)作用。由于RIC的無(wú)創(chuàng)性，而且肌肉組織對(duì)缺血的耐受性較好，已經(jīng)由臨床試驗(yàn)證實(shí)對(duì)急性腦缺血是有效的[1]。理論上講，RIC對(duì)慢性腦灌注不足的患者同樣應(yīng)該有效，并已經(jīng)被研究證實(shí)[2，3]，然而相關(guān)的研究數(shù)量較少，而且關(guān)于RIC在慢性腦灌注不足過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制尚不完全清楚。作為一種低成本、低風(fēng)險(xiǎn)、無(wú)創(chuàng)性、易實(shí)施的方法，RIC在慢性腦灌注不足中的應(yīng)用以及相關(guān)的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制值得總結(jié)及探究。

1 慢性腦灌注不足引發(fā)的病理生理過(guò)程

慢性腦灌注不足已被認(rèn)為是血管性癡呆的危險(xiǎn)因素，且能夠加速阿爾茨海默病患者的認(rèn)知衰退。大量證據(jù)表明，慢性腦灌注不足可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[4]，其潛在的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制包括：(1)加速β淀粉樣蛋白(Aβ)的聚集；(2)誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥；(3)引起谷氨酸的興奮毒性；(4)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡；(5)自噬障礙等。

2 RIC可以抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)Aβ的聚集

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)的主要病理改變是Aβ聚集以及形成老年斑，Aβ是β淀粉樣蛋白前體(APP)被β-和γ-分泌酶水解產(chǎn)生的[4]。據(jù)報(bào)道，慢性腦灌注不足可以加速Aβ在腦中的沉積并聚集。雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄(bilateral carotid artery stenosis，BCAS)模型誘導(dǎo)的慢性腦灌注不足，可以使大腦皮層中Aβ的形成增加并誘導(dǎo)其在細(xì)胞內(nèi)的沉積[5]。慢性腦灌注不足不僅可以引起Aβ在神經(jīng)元的沉積，還可引起在小動(dòng)脈壁的沉積，導(dǎo)致腦血管病變，使腦血管壁增厚、脆性增加及管腔狹窄，既可以引起腦血流灌注不足，也可以引起梗死和出血[6]。

Khan等在C57/B6雄性小鼠中通過(guò)BCAS模型誘導(dǎo)慢性腦灌注不足。20只小鼠隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組，BCAS組，BCAS+RIC組。RIC在BCAS造模后1 w施行，每天1次持續(xù)治療2 w。在BCAS造模后4 w進(jìn)行認(rèn)知測(cè)試，并取腦組織進(jìn)行生物化學(xué)檢測(cè)。組織學(xué)顯示，未予以RIC的，Aβ在額葉皮層和海馬中明顯增多；而RIC處理后，Aβ明顯減少，也明顯改善了認(rèn)知功能[1]。

3 RIC可減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)

慢性腦灌注不足誘導(dǎo)腦組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，以及淋巴細(xì)胞等外周免疫細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的侵入[6，7]。在慢性腦灌注不足模型動(dòng)物的腦組織中可以發(fā)現(xiàn)：小膠質(zhì)細(xì)胞的MHC I類分子、MHC II 類分子、白細(xì)胞共同抗原、CD11b、Iba1[8]的表達(dá)上調(diào)，和星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，表明二者被激活；多種外周免疫細(xì)胞向腦組織浸潤(rùn)，例如CD4+及CD8+的T淋巴細(xì)胞出現(xiàn)在白質(zhì)、大腦皮層以及丘腦和海馬的灰質(zhì)中[7]，MPO陽(yáng)性的中性粒細(xì)胞也在腦組織浸潤(rùn)[9]。小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活后可以產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)、趨化因子及TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子，加重腦組織損傷[10]，侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的外周免疫細(xì)胞，例如來(lái)源于單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞，能夠釋放谷氨酸并通過(guò)激活周邊的神經(jīng)元上的谷氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)發(fā)揮神經(jīng)毒性作用[11]；CD4+T細(xì)胞可產(chǎn)生TNF-α等多種細(xì)胞因子[12]；CD8+T細(xì)胞直接通過(guò)其介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生損傷。除腦實(shí)質(zhì)的炎癥反應(yīng)外，血管炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物ICAM-1 和VCAM-1的表達(dá)也出現(xiàn)上調(diào)[8]。

已有研究發(fā)現(xiàn)，RIC可以抑制慢性腦灌注不足引起的血管炎癥反應(yīng)以及星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，下調(diào)ICAM-1和VCAM-1在mRNA水平的表達(dá)，也使星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物GFAP和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba1在蛋白水平的表達(dá)下調(diào)[8]。此外，在急性腦缺血/再灌注損傷的過(guò)程中，RIC可以抑制多種外周免疫細(xì)胞，例如T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的浸潤(rùn)[13]。亦有研究表明，在急性腦缺血/再灌注模型中，RIC可以降低缺血腦皮質(zhì)中的髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性，而增加缺血腓腸肌中的MPO活性，提示RIC可能將中性粒細(xì)胞“吸引”在實(shí)施遠(yuǎn)隔后處理的肢體肌肉組織內(nèi)，從而減輕中性粒細(xì)胞向腦組織的浸潤(rùn)，并通過(guò)MyD88/TRAF6/p38-MAPK途徑下調(diào)外周血的中性粒細(xì)胞中NADPH氧化酶的活化，抑制外周血和大鼠腦組織的中性粒細(xì)胞的激活[11]。RIC抑制外周免疫細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的浸潤(rùn)在急性腦缺血模型中已經(jīng)被證實(shí)[13，14]，能否在慢性腦灌注不足過(guò)程中發(fā)揮類似的作用目前還不清楚。

4 RIC可減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)谷氨酸的興奮毒性

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其細(xì)胞外含量在正常生理狀況下處于低水平。在病理情況下，胞外谷氨酸可以過(guò)量積聚，通過(guò)發(fā)揮興奮毒性介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的死亡。

缺氧可以導(dǎo)致神經(jīng)元去極化，導(dǎo)致大量谷氨酸釋放到突觸間隙[15]，引發(fā)興奮毒性；慢性缺血導(dǎo)致的能量供應(yīng)障礙也可能會(huì)導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞和軸突通過(guò)EAATs (excitatory amino acid transporter，興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體)的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)釋放谷氨酸[16]。過(guò)量的谷氨酸既可以損傷神經(jīng)元，也可以作用于少突膠質(zhì)細(xì)胞上的NMDAR、AMPAR等谷氨酸受體，介導(dǎo)對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，引起白質(zhì)疏松等病理改變[17]。Vicente等通過(guò)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法建立大鼠慢性腦灌注不足模型，10 w后進(jìn)行大鼠的認(rèn)知功能評(píng)估并取腦組織制作海馬切片。結(jié)果顯示，慢性腦灌注不足可以引起明顯的認(rèn)知功能障礙，且海馬切片對(duì)谷氨酸的攝取能力顯著降低，二者之間呈正相關(guān)[18]，顯示認(rèn)知能力的受損與胞外谷氨酸過(guò)度積聚引起的神經(jīng)毒性有關(guān)。已有研究報(bào)道，在急性腦缺血模型中，RIC可以上調(diào)谷氨酰胺合成酶的表達(dá)，促進(jìn)谷氨酸的利用，減少胞外谷氨酸的積聚[19]。谷氨酸興奮毒性是存在于急性以及慢性腦缺血過(guò)程中的共同的病理生理過(guò)程，RIC或許能夠在慢性腦灌注不足中發(fā)揮相似的機(jī)制。

5 RIC可誘導(dǎo)外泌體的產(chǎn)生

細(xì)胞通過(guò)分泌外泌體，將信號(hào)分子(包括miRNA，多種細(xì)胞通路相關(guān)蛋白等)分泌到較遠(yuǎn)的組織或細(xì)胞中，以起到調(diào)控作用。外泌體作為人體內(nèi)一類重要的運(yùn)輸囊泡，參與調(diào)節(jié)多個(gè)細(xì)胞傳導(dǎo)通路，發(fā)揮重要的生理作用，開(kāi)始受到越來(lái)越多的關(guān)注。多種細(xì)胞(包括內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞等)來(lái)源的外泌體均對(duì)缺血性腦損傷具有保護(hù)作用，它們可以穿過(guò)血腦屏障，將其中攜帶的信號(hào)分子運(yùn)輸至中樞神經(jīng)系統(tǒng)[20]，通過(guò)多種機(jī)制，例如抑制神經(jīng)元凋亡、減輕谷氨酸興奮毒性等對(duì)腦組織進(jìn)行保護(hù)。例如，Kalani等發(fā)現(xiàn)，外泌體可以減輕腦缺血/再灌注小鼠的梗死體積和水腫程度，降低中樞神經(jīng)谷氨酸受體NMDAR的表達(dá)[21]；Wei等指出外泌體可以通過(guò)PI3K/Akt通路減輕谷氨酸的神經(jīng)毒性[22]；脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體中含有色素上皮衍生因子(PDEF)，對(duì)急性缺血/再灌注的腦組織具有保護(hù)作用，可能與其激活自噬和抑制神經(jīng)元凋亡有關(guān)[23]。此外，外泌體發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制還涉及其他方面，例如抑制髓鞘的減少等[24]。

RIC能否通過(guò)外泌體對(duì)缺血腦組織產(chǎn)生影響，近些年來(lái)也有學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)研究。Xiao等研究了RIC對(duì)急性腦缺血的保護(hù)作用[25]。他們通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在肢體進(jìn)行RIC可以增加血漿中外泌體的含量，且它們的形態(tài)與內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體相似。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞系進(jìn)行氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧模型，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，抑制Bax的表達(dá)，減輕神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。因而，RIC可能通過(guò)誘導(dǎo)肢體血管的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生外泌體從而抑制大腦中神經(jīng)元的凋亡，可能是其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制[25]。細(xì)胞凋亡是存在于急性和慢性腦缺血過(guò)程中的共同的病理生理過(guò)程，因而RIC或許也能通過(guò)相似的機(jī)制減輕慢性腦灌注不足引發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，但仍需要相關(guān)研究的證明。另外，外泌體的來(lái)源多種多樣，包括內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞等。脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腦缺血發(fā)揮的保護(hù)作用已經(jīng)被研究證實(shí)[23]，且肢體的皮下脂肪豐富，RIC引起肢體的缺血介導(dǎo)脂肪組織的缺血缺氧，可能引發(fā)一系列生理變化，但能否介導(dǎo)脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌外泌體，尚未見(jiàn)相關(guān)研究。

6 RIC可能誘導(dǎo)保護(hù)性氣體類信使分子的產(chǎn)生

近些年越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注外周血中的多種氣體類信使分子，例如CO、NO等。它們可以由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，隨血液循環(huán)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)揮作用。內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO可以擴(kuò)張腦血管、增加腦血流[26]，CO則能夠抗氧化、阻止血腦屏障破壞[27]、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生、抗細(xì)胞凋亡以及抗炎[28]等。

缺氧可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO以及CO[29，30]。RIC通過(guò)對(duì)外周肢體使用袖帶加壓阻斷肢體血流后再?gòu)?fù)流，導(dǎo)致肢體相應(yīng)部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧，可能誘導(dǎo)NO及CO的生成，但其能否減輕慢性腦灌注不足引起的神經(jīng)損傷，目前并未有直接的研究證實(shí)。

7 RIC可能減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡

慢性腦灌注不足可以導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，是引起認(rèn)知功能障礙的重要原因之一。

Bax是重要的促凋亡基因，與之相反，Bcl-2則發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用，二者在與凋亡相關(guān)的研究中被廣泛關(guān)注，特別是Bcl-2/Bax比率，常被用于評(píng)估細(xì)胞的凋亡狀態(tài)。Stanojlovic等在研究中通過(guò)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法建立大鼠慢性腦灌注不足模型，在mRNA水平發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，慢性腦灌注不足大鼠海馬中的Bcl-2水平顯著降低，Bax水平顯著升高，Bcl-2/Bax比率降低。同時(shí)，通過(guò)分離海馬組織的各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)行Western blot檢測(cè)Bcl-2，Bax等凋亡相關(guān)蛋白。與對(duì)照組相比，慢性腦灌注不足大鼠海馬的神經(jīng)元線粒體以及突觸中的Bcl-2和Bax，在蛋白水平同樣存在上述趨勢(shì)，與mRNA 水平一致[31]。已有研究表明RIC可以抑制神經(jīng)元的凋亡，并能夠在蛋白水平顯著提升Bcl-2，并降低Bax水平，進(jìn)而提高Bcl-2/Bax比率，但此研究結(jié)果涉及的領(lǐng)域仍局限于急性腦缺血/再灌注[32]。

RIC引起上述結(jié)果的機(jī)制可能涉及多種通路，例如JAK2/STAT3通路的激活[32]。然而，關(guān)于STAT3對(duì)于細(xì)胞的作用仍有爭(zhēng)議，盡管已有研究認(rèn)為STAT3的激活可以促進(jìn)細(xì)胞存活，但也有部分研究人員認(rèn)為它與細(xì)胞死亡相關(guān)。因而，RIC引發(fā)的Bcl-2/Bax比率提高是否確實(shí)與JAK2/STAT3通路的激活有關(guān)，還需應(yīng)用JAK2/STAT3通路的特異性抑制劑進(jìn)行進(jìn)一步檢驗(yàn)。此外，PI3K/Akt也是被研究較多的通路。已有研究表明，慢性腦灌注不足可以引起海馬神經(jīng)元胞質(zhì)和突觸中p-Akt水平的下降[31]，提示Akt的磷酸化過(guò)程被抑制可能是慢性腦灌注不足引起B(yǎng)cl-2/Bax比率下降以及細(xì)胞凋亡的原因。而RIC可以激活PI3K/Akt通路。Yu等發(fā)現(xiàn)，RIC通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路提高Bcl-2/Bax比率，誘發(fā)心臟保護(hù)效應(yīng)[33]。RIC對(duì)PI3K/Akt通路的激活作用也已經(jīng)在急性腦缺血/再灌注模型中被證實(shí)[34]。細(xì)胞凋亡是存在于急性和慢性腦缺血過(guò)程中的共同的病理生理過(guò)程，因而RIC或許可以通過(guò)相似的機(jī)制減輕慢性腦灌注不足引發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

8 RIC可能通過(guò)調(diào)節(jié)自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用

關(guān)于自噬，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同的病理生理過(guò)程中發(fā)揮的作用是一把雙刃劍，根據(jù)損傷類型以及自噬的程度不同，自噬發(fā)揮的作用也不同。適度自噬可以清除細(xì)胞內(nèi)衰老的細(xì)胞器以及錯(cuò)誤折疊蛋白，但過(guò)度自噬可能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞死亡。關(guān)于自噬在慢性腦灌注不足發(fā)展過(guò)程中的作用，目前的大多數(shù)研究認(rèn)為，長(zhǎng)期的慢性腦灌注不足會(huì)引起自噬的過(guò)度激活以及自噬過(guò)程異常，加劇神經(jīng)元死亡及認(rèn)知功能減退。

Yang等認(rèn)為，腦灌注不足可以引起小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和自噬過(guò)程，加劇白質(zhì)病變和白質(zhì)缺陷；而自噬抑制劑(3-甲基腺嘌呤)可以抑制其自噬激活，減輕白質(zhì)損傷并改善記憶[35]。Chen等認(rèn)為，自噬加劇了雙側(cè)頸動(dòng)脈狹窄的大鼠的神經(jīng)元損傷[36]。此外，Zou等發(fā)現(xiàn)，在慢性腦灌注不足發(fā)生后，自噬過(guò)程被激活，大鼠皮層和海馬中的自噬相關(guān)蛋白(Beclin-1，LC3B-Ⅱ，P62)增加。Beclin-1是自噬體形成的關(guān)鍵組成部分，LC3B-Ⅱ有助于自噬體的延伸與成熟，二者的增加表明自噬過(guò)程被激活、自噬體的形成增加；P62可以整合到被降解的自噬體中，所以其升高表明自噬體的降解過(guò)程受損。因而慢性腦灌注不足會(huì)引起自噬啟動(dòng)的過(guò)度激活導(dǎo)致自噬體增加，但由于溶酶體成熟的缺陷等原因，自噬的降解過(guò)程受損。這種不完整不成熟的異常自噬過(guò)程，導(dǎo)致?lián)p傷的細(xì)胞器和異常蛋白質(zhì)(如Aβ)不能成功清除，引起認(rèn)知減退等不良神經(jīng)功能結(jié)果[37]。與此結(jié)論一致，Che等的研究同樣表明慢性腦灌注不足會(huì)引發(fā)自噬的激活以及自噬體的增加，但自噬體的降解過(guò)程受抑制[38]。

而RIC可以通過(guò)多種通路調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自噬過(guò)程，但不同的研究顯示出不同甚至相反的結(jié)論。在急性腦缺血/再灌注過(guò)程中，RIC可以通過(guò)mTOR/p70S6K通路抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自噬，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[39]；而另有研究表明，在蛛網(wǎng)膜下腔出血模型中，RIC可以促進(jìn)自噬，上調(diào)大腦皮層中的Beclin-1及LC3B-Ⅱ蛋白，促進(jìn)自噬溶酶體的增加，保護(hù)神經(jīng)元，改善短期及長(zhǎng)期結(jié)局[40]。尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于RIC在慢性腦灌注不足過(guò)程中如何調(diào)節(jié)自噬的相關(guān)報(bào)道，或許可以作為進(jìn)一步研究的方向。

9 臨床應(yīng)用

我們通過(guò)文獻(xiàn)的整理與分析得出，RIC可能通過(guò)：減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)β淀粉樣蛋白(Aβ)的聚集、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)、減輕谷氨酸興奮毒性、誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)因子例如NO、CO和外泌體的產(chǎn)生、減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及調(diào)節(jié)自噬過(guò)程等，在慢性腦灌注不足過(guò)程中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，然而這些潛在的機(jī)制仍需進(jìn)一步證實(shí)。鑒于對(duì)臨床患者施行RIC具有安全性及易操作性，其廣泛應(yīng)用于臨床多種疾病的前景是非常誘人的，例如多種臟器的急性缺血、蛛網(wǎng)膜下腔出血等，也包括慢性腦灌注不足。已有研究顯示RIC對(duì)于慢性腦灌注不足也具有神經(jīng)保護(hù)作用，其內(nèi)在的機(jī)制以及從基礎(chǔ)研究向臨床實(shí)際應(yīng)用的轉(zhuǎn)化是一個(gè)有趣但相對(duì)空白的研究領(lǐng)域。