趙焱

730046蘭州,中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室動物生物安全三級實驗室實驗室生物安全委員會辦公室

在病毒的檢測領域，快速、靈敏、特異與準確的鑒定方法始終是關注的焦點。通常，基于細胞培養(yǎng)的鑒定方法被認為是金標準，但它需要數(shù)天時間才能完成，耗時、耗力。核酸檢測法也被廣泛地使用，最常見的方法是常規(guī)PCR、qPCR和環(huán)介導等溫擴增反應等，但這些方法無法測定病毒的感染性。近些年，新檢測方法的研發(fā)從推陳出新的核酸結合染料中找到了新思維。疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)可用于病原體核酸提取前預處理樣品，使其共價交聯(lián)于失活病原體的核酸上并阻斷核酸擴增，從而區(qū)分病原體是否存活[1]。目前，PMA-核酸檢測法可檢測活的病原體，如細菌[2]及其芽孢[3]、病毒[4-5]、寄生蟲[6]等，并應用于不同的領域，如環(huán)境衛(wèi)生、食品安全、病原診斷等。

本文綜述了PMA-核酸檢測法的基本原理、步驟、優(yōu)勢與局限、各因素的影響及新進展，旨在系統(tǒng)地總結測定病毒感染性的PMA-核酸檢測法，為其深入研究和應用提供理論依據(jù)。

1 基本原理

PMA是由Biotium公司發(fā)明的一種高親和力、光敏的核酸結合染料。在光解作用下，PMA上的光敏疊氮基團轉變?yōu)楦叻磻缘牡┳杂苫说┳杂苫c結合位點的烴基極易形成穩(wěn)定的氮碳共價鍵，從而達到永久性的核酸修飾[7]。當PMA修飾到核酸上后，其本身具有的微弱熒光變強，此熒光特性并非PMA-核酸檢測法的機理。其機理是共價修飾到核酸上的PMA阻礙了后續(xù)核酸檢測中核酸與引物等的配對，故而改變了被檢核酸的擴增效率。另外，PMA與核酸共價交聯(lián)后，水分子與多余的游離PMA反應終止了PMA的結合能力，生成的羥胺避免了后續(xù)DNA提取步驟中的額外修飾[8-9]。

PMA-核酸檢測法的另一個機理是PMA幾乎完全不可滲透細胞膜[7]，細胞膜的完整與否決定了PMA是否能接近并修飾核酸及其后續(xù)的檢測結果[10]。PMA可選擇性地穿過破損的病毒包膜與衣殼而結合到病毒核酸，由病毒結構完整性區(qū)分了活病毒和失活病毒，從而測定了病毒的感染性。

2 PMA預處理步驟

與常規(guī)核酸檢測法相比，PMA-核酸檢測法在核酸提取的步驟前增加了PMA預處理[11]。PMA預處理病毒的方法是，根據(jù)PMA/病毒濃度比，將適量PMA加入病毒懸液后輕柔震蕩混勻，樣品室溫避光孵育5～10 min，再在特定光源的照射下曝光10～30 min，光源需距離樣品管10～20 cm，曝光期間樣品經(jīng)常輕柔震蕩混勻。

在PMA預處理的過程中，PMA選擇性地穿過破損的包膜與衣殼而共價修飾核酸，結合到核酸上的PMA阻礙了后續(xù)核酸檢測，從而達到測定病毒感染性的目的。另外，Parshionikar[12]利用此法檢測水樣中腸道病毒時發(fā)現(xiàn)，即使樣品中有失活病毒存在仍能成功檢出活病毒。Bellehumeur證實[13]，PMA預處理含豬繁殖與呼吸綜合征病毒的臨床組織樣品后，宿主細胞的核酸成分被PMA交聯(lián)，其后續(xù)的核酸擴增被阻斷，從而提高了DNA矩陣和高通量測序的病毒檢測靈敏性。

3 與其他測定病毒感染性方法的比較

樣品中病毒的檢測方法各有優(yōu)劣，但都被廣泛地應用于不同的領域。在某些情況下，不僅病毒的量是期待獲得的數(shù)據(jù)，而且病毒的感染性更值得關注。即檢測數(shù)據(jù)同時來源于活病毒和失活病毒[14-15]，故直接測定活病毒的新方法逐漸被關注。

通常，測定病毒感染性的方法可分為兩類:第一類是基于病毒的復制能力，第二類是基于病毒的結構完整性。基于病毒復制能力的方法包括動物感染實驗、細胞培養(yǎng)實驗[5，12，16]及細胞培養(yǎng)與聚合酶鏈式反應的聯(lián)用法[17]，依據(jù)實驗結果可直接判定病毒的感染性，耗時相對較長且成本昂貴；而基于病毒結構完整性的方法主要是衣殼蛋白氧化損傷的檢測[18]、酶處理-核酸檢測法[19]及PMA-核酸檢測法，這些方法相對簡單、廉價，依據(jù)實驗結果只能提示病毒的感染性。與酶處理-核酸檢測法相比，PMA的化學特性比酶的更加穩(wěn)定，不易受其他成分的影響而變性，而且PMA預處理的時間更短，多余的PMA與水反應而失活不會干擾后續(xù)實驗，故PMA-核酸檢測法的應用范圍更廣。PMA-核酸檢測法是一種結合病毒衣殼完整性和核酸穩(wěn)定性的預測病毒感染性的方法，但通過實驗條件的優(yōu)選及與細胞培養(yǎng)實驗的關聯(lián)，其結果亦可直接判定病毒的感染性。

4 影響因素

4.1 病毒結構 病毒的結構成分包括核酸、衣殼和囊膜。病毒核酸上的烴基是光解作用下PMA的結合位點[7]。PMA-核酸檢測法已被用于巴爾的摩病毒分類系統(tǒng)中各主要類型的病毒，如I類(雙鏈DNA)的T4噬菌體和腺病毒、II類(單鏈 DNA)的ΦX174噬菌體、III類(雙鏈 RNA)的輪狀病毒、IV類(正鏈RNA)的脊髓灰質炎病毒和諾如病毒等，可見此法受病毒核酸類型(DNA/RNA、單鏈/雙鏈、正鏈/負鏈)的影響不大[5，11-12，20-21]。

與囊膜相比，衣殼的結構更加穩(wěn)固、不易被破壞，能破壞衣殼的因素和強度通常也能完全破壞囊膜，因此本文中討論破壞病毒囊膜和衣殼的因素以衣殼為主。鼠諾如病毒衣殼由90個二聚體組成，每個二聚體是一個巨蛋白[22]。脊髓灰質炎病毒衣殼由60個亞單位按二十面體對稱排列，每個亞單位包括4個病毒多肽，故其能夠在生理溫度經(jīng)受構象的改變從而在衣殼完整的狀態(tài)下失去感染性[23]。各病毒衣殼結構的差異導致了病毒對各滅活方式的敏感性不同，成功的PMA-核酸檢測法中各病毒被滅活的溫度高低就印證了這一觀點[24]。例如，T4噬菌體的熱滅活溫度為110℃[8]，腸道病毒的熱滅活溫度為 37℃[12]，鼠諾如病毒的熱滅活溫度為72℃[24]。因此，對于不同病毒，PMA預處理的實驗條件不能混用，都需逐一摸索。

4.2 滅活方式 測定病毒感染性的PMA-核酸檢測法的首要關注點是囊膜或衣殼的完整性。與囊膜相比，衣殼的完整性更加穩(wěn)固、不易被破壞，所以無論病毒是否有囊膜，破壞衣殼的因素和程度是此法成敗的關鍵。常見破壞病毒的方法有高溫法、高壓法、紫外線法及氯滅活法[5，24-26]，各方法滅活病毒的原理不同，對衣殼完整性的影響也不盡相同，故并不完全適用于PMA-核酸檢測法。例如，紫外線僅破壞病毒的核酸[5]，不影響衣殼的完整性，故PMA-核酸檢測法不能預測紫外線滅活病毒的感染性。高壓僅引起衣殼蛋白的微小變化，并不足以保證PMA接近核酸，因此蛋白酶K與PMA共同預處理病毒可能改進PMA-核酸檢測法[25]。

高溫法處理病毒是相對可靠、穩(wěn)定的方法，也是PMA-核酸檢測法中研究最多的滅活方式。高溫僅破壞病毒的衣殼蛋白[5]，不同溫度對衣殼蛋白的效應迥異[12]，可歸納為三類:溫度足夠高而直接破壞了衣殼的完整性，PMA能進入衣殼并交聯(lián)于核酸上，PMA-核酸檢測法能區(qū)分病毒是否存活；較高的溫度改變了病毒衣殼蛋白的構象而不影響衣殼的完整性，故致病毒感染性喪失，細胞培養(yǎng)雖能分辨出病毒感染性，但PMA-核酸檢測法不能區(qū)分病毒是否存活；較低的溫度不破壞病毒衣殼而不能作為PMA-核酸檢測法的病毒滅活溫度。另外，由于各病毒的衣殼組成和結構不同，相同溫度對各病毒的處理導致不同滅活結果[24]，故適用于PMA-核酸檢測法的病毒滅活溫度需通過實驗摸索。

游離的氯對病毒核酸和衣殼都有顯著作用，通常氯最先損壞病毒核酸，隨著氯濃度或劑量的升高而破壞病毒蛋白[27]。Karim等[24]證實了，當?shù)吐菴t值被用于滅活的鼠諾如病毒時，PMA-核酸檢測法并不適用；而當高氯Ct值被應用時，PMA-核酸檢測法成功地區(qū)分了感染性和氯滅活的鼠諾如病毒。因此氯滅活法對衣殼結構的改變足以使PMA進入并交聯(lián)于被滅活病毒的核酸上[5，12，24]。由于氯破壞核酸的二級結構(如5’NCR)[25]，故需斟酌PCR擴增區(qū)域以避免失敗。

4.3 實驗條件 PMA-核酸檢測法的關鍵參數(shù)是PMA/病毒濃度比。最佳比值的選取應該最大化抑制結構破損病毒的信號，即PMA的量相對于病毒的量(或病毒核酸的量)要相對飽和，以保證所有的結構破損病毒的核酸都能被PMA非特異性地封閉，同時過量的PMA與水反應而失去活性。這能有效地抑制結構破損病毒的核酸擴增，而不影響結構完整病毒的核酸擴增。

影響PMA與樣本孵育的要素包括孵育時間和溫度。孵育時間需確保PMA滲透并交聯(lián)于核酸上。當PMA/病毒濃度比值高時，孵育時間應盡量縮短以免產生假陽性；反之，孵育時間可靈活調節(jié)[1，28]。

在光照階段，為PMA光解反應提供光源的是鹵素燈管[5]、光二極管[29]、Biotium的 PMA-Lite LED光解裝置[7]等，這些燈管的功率須符合實驗要求。光照距離和時間是優(yōu)化實驗的兩個參數(shù)。光照時間決定了PMA的活化、與核酸的交聯(lián)及多余PMA結合能力的終止。充足的照射時間不僅滿足了PMA與核酸充分交聯(lián)的需要，而且通過終止多余PMA的結合能力保證了后續(xù)實驗的可靠性。常規(guī)的照射時間小于30 min，但尚無確切的最優(yōu)照射時間報道。對于各實驗，最優(yōu)照射時間需根據(jù)照射距離不斷地摸索、優(yōu)化。

5 總結

通常，病毒核酸片段的檢測結果不足以判定病毒的感染性。然而，無論病毒核酸的類型，PMA-核酸檢測法都能測定病毒的感染性。此法不僅受樣品處理方式、滅活方式等前處理方案的影響，而且被諸多的實驗參數(shù)所干擾，如PMA/病毒濃度比、PMA孵育條件、光源的選擇及光照參數(shù)等。經(jīng)過實驗參數(shù)的優(yōu)化及與細胞培養(yǎng)實驗的關聯(lián)，其結果可更準確地判定病毒的感染性。

PMA-核酸檢測法與細胞培養(yǎng)等實驗相比，更加簡單、廉價，耗時更短，且不易受樣品中某些化學成分的干擾。與酶處理-核酸檢測法比較，PMA的化學特性比酶的更加穩(wěn)定，PMA預處理樣品的時間更短，多余的PMA與水反應而不會干擾后續(xù)實驗，故PMA-核酸檢測法更具有優(yōu)勢。另外，這種方法檢測病毒的種類更多，不僅可檢測感染細胞后致細胞病變的病毒，而且可檢測感染細胞后不致細胞病變的病毒和在細胞系上生長不良的病毒。此法最大的特點是快捷，故其結果可為公共衛(wèi)生、應急調查、高級別生物安全實驗室管理等提供及時、準確的決策依據(jù)。

利益沖突無