， ，

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

西紅花是鳶尾科(Iridaceae)番紅花屬(Crocus)植物番紅花(Crocus sativus L.)干燥的柱頭[1]，又名藏紅花、咱夫蘭.元朝時(shí)由“天方國”傳到西藏再傳入中原，最早見于元朝飲膳太醫(yī)忽思慧所著《飲膳正要》：“咱夫蘭，味甘，平，無毒.主心憂郁積，氣悶不散，久食令人心喜.”其入藥部位花柱的產(chǎn)量極低，價(jià)格昂貴，被譽(yù)為“植物黃金”.西紅花花瓣是制藥工業(yè)中的副產(chǎn)物，含有許多的活性成分，已有學(xué)者從中分離得到黃酮、多糖、皂甙等物質(zhì)[2-3]，現(xiàn)代藥理藥效顯示，西紅花花瓣具有抗氧化、抗抑郁和抑制酪氨酸酶等[4-6]多種藥理活性.目前已經(jīng)分離得到了以山奈酚為苷元的黃酮苷類化合物、單萜類以及單苯環(huán)類化合物共35個(gè).指紋圖譜技術(shù)是國際公認(rèn)的控制中藥質(zhì)量的最常用手段[7].相似度評(píng)價(jià)、主成分分析與聚類分析在中藥指紋圖譜研究中最常使用[8]，通過聚類分析可以將對(duì)象集合中相近或者相似的對(duì)象聚集到同一個(gè)類中，最后得到幾個(gè)不同的類劃分[9].西紅花花瓣不易儲(chǔ)存，目前尚沒有對(duì)西紅花花瓣的烘干的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不同的烘干方法對(duì)西紅花花瓣中主要化學(xué)成分影響的研究未見報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)基于西紅花花瓣的HPLC指紋圖譜技術(shù)，探討烘干工藝對(duì)對(duì)西紅花花瓣化學(xué)成分的影響，并尋找最優(yōu)烘干工藝.

1 儀器與試藥

Agilent 1260 HPLC液相色譜儀(美國Agilent公司)；KQ-100DE超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；DZF-6050真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；WD700微波爐(樂金電子電器有限公司)；0.45 μm有機(jī)針孔過濾器(上海興亞凈化材料廠)；乙腈、甲醇為色譜純(美國Tedia公司)；哇哈哈純凈水.

新鮮西紅花花瓣(產(chǎn)地浙江省建德市三都鎮(zhèn)和村，批次：2016年)，經(jīng)浙江工業(yè)大學(xué)大學(xué)王平教授鑒定為CrocussativusL.的新鮮花瓣；對(duì)照品山奈酚3-O-槐糖苷、異鼠李素3,4’-二-O-β-葡萄糖苷為實(shí)驗(yàn)室分離制得，經(jīng)1H-NMR、13C-NMR鑒定結(jié)構(gòu).

2 試驗(yàn)方法

2.1 西紅花花瓣的烘干方法

取新鮮西紅花花瓣約10 g，精密稱定，置于不同烘干設(shè)備中，按照表1的烘干參數(shù)進(jìn)行干燥，取出，再次精密稱定，然后將樣品放置在干燥器中，備用，一式三份.測(cè)定樣品脫水率，制作指紋圖譜.新鮮西紅花花瓣的脫水率公式為

脫水率=[(M1-M2)/M1]×100%

式中：M1，M2分別為脫水前后樣品質(zhì)量.

表1 樣品參數(shù)及脫水率Table 1 Parameter and dehydration rate of samples

注：1) P1～P8為恒溫鼓風(fēng)干燥法；Z1～Z6為真空干燥法；L1為冷凍干燥法；W1～W8為微波干燥法.

2.2 待測(cè)液的制備

供試品溶液的制備：取西紅花花瓣約100 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇溶液10 mL，稱重，在40 ℃下超聲提取40 min，采用70%甲醇溶液補(bǔ)足重量，搖勻，過濾，濾液再用0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過濾，在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

對(duì)照品溶液的制備：分別取山奈酚3-O-槐糖苷和異鼠李素3,4’-二-O-β-葡萄糖苷約10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，溶液用0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過濾，在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

2.3 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，4 μm)；流速0.5 mL/min；檢測(cè)波長260 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相為乙腈(A)和0.05%三氟乙酸(B)；梯度洗脫時(shí)A和B的比例為0～5 min，5∶95；5～10 min，20∶80；10～25 min，20∶80；25～30 min，50∶50；30～40 min，70∶30.

2.4 方法學(xué)考察

1) 精密度的考察.取同一份供試液，按2.3項(xiàng)下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果各特征色譜峰峰面積和保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation RSD)分別小于2.36%和1.01%.采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版”軟件計(jì)算相似度為1，說明儀器的精密度較好.

2) 重復(fù)性的考察.取同一批花瓣樣品5份，分別按照2.2項(xiàng)下的方法制備成供試液，依次進(jìn)樣，結(jié)果各特征色譜峰峰面積和保留時(shí)間的RSD值分別小于2.69%和1.34%，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版”軟件計(jì)算相似度均高于0.99，說明該方法的重復(fù)性較好.

3) 穩(wěn)定性的考察.取同一份供試液，分別于0，4，8，12，16 h分別進(jìn)樣，結(jié)果各特征色譜峰峰面積和保留時(shí)間的RSD值分別小于3.68%和0.96%，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版”軟件計(jì)算相似度均高于0.99，說明供試液在16 h之內(nèi)穩(wěn)定性較好[10].

2.5 指紋圖譜的建立

以鮮花瓣為參照，取新鮮西紅花花瓣500 mg,按2.2項(xiàng)下方法制備供試液，供試液指紋圖譜共標(biāo)識(shí)9個(gè)共有特征峰(圖1).其中，6和7號(hào)峰分別對(duì)應(yīng)山奈酚3-O-槐糖苷和異鼠李素3,4’-二-O-β-葡萄糖苷(17.02，19.01 min).

圖1 新鮮西紅花花瓣指紋圖譜Fig.1 The fingerprint of fresh petals of Crocus sativu

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 西紅花花瓣脫水率

不同參數(shù)下西紅花花瓣脫水率如表1所示，普通恒溫鼓風(fēng)干燥箱在70，80 ℃下干燥45 min、真空干燥箱在70，80 ℃下干燥45 min、冷凍干燥和微波干燥，脫水率均高于80%，冷凍干燥較為費(fèi)時(shí)，不利于工業(yè)生產(chǎn)，而微波干燥效率較高.4種干燥方法的脫水速率為，微波干燥>普通干燥、真空干燥>冷凍干燥.

3.2 干燥工藝對(duì)西紅花花瓣指紋圖譜特征峰的影響

西紅花花瓣中含有大量黃酮類成分，在260 nm(帶Ⅱ)處有較強(qiáng)的紫外吸收，且該波長下指紋圖譜中的色譜峰個(gè)數(shù)較多，分離度良好，故設(shè)260 nm為檢測(cè)波長.由于編號(hào)P1，P2，P3，Z1，4批樣品含水量較多，很快發(fā)生霉變，故沒有進(jìn)一步分析，其余的19批不同干燥條件下的花瓣樣品(S2～S20)和新鮮花瓣樣品(S1)的指紋圖譜色譜峰疊加圖如圖2所示.采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版軟件”[11]進(jìn)行相似度分析，以鮮花瓣圖譜為參照譜[12]，結(jié)果各譜圖相似度大于0.97(表2)，說明不同烘干方法和烘干工藝的樣品化學(xué)成分種類差異性較小，物質(zhì)基礎(chǔ)沒有變.共有的9個(gè)特征峰峰面積除以樣品干重的RSD值計(jì)算結(jié)果顯示，峰2，3，5，8的RSD值均大于50%，其中峰8高達(dá)92.70%(表3)，說明不同樣品雖然化學(xué)成分種類差異較小，但化學(xué)成分含量差異性明顯，因此烘干方法和烘干工藝主要對(duì)西紅花花瓣中化學(xué)成分含量造成較大影響.圖2顯示，整體上烘干后的樣品各色譜峰強(qiáng)度均有所減弱，尤其是2，3，6，8號(hào)色譜峰.普通干燥P7(S6)、真空干燥Z3(S9)樣品在該濃度下無法檢測(cè)到2號(hào)峰，且普通干燥條件下所有的3號(hào)峰強(qiáng)度大幅度減弱.另外，普通干燥、真空干燥和冷凍干燥條件下所有的8號(hào)色譜峰強(qiáng)度也大幅度減弱，但微波干燥對(duì)該峰的保留較佳.通過計(jì)算，W6色譜峰峰面積/干重的合計(jì)值最高，說明中高火微波8 min可以較好的保留西紅花花瓣的化學(xué)成分，該烘干方法為干燥花瓣的較佳方法.

表2 不同樣品HPLC指紋圖譜相似度Table 2 Similarity of fingerprint from different samples

表3 9個(gè)共有峰的峰面積/干重的RSDTable 3 RSD of peak area/ dry weight from 9 common peaks

S1—鮮花瓣樣品；S2～S6—P4～P8；S7～S11—Z2～Z6；S12—L1；S13～S20—W1～W8圖2 20批樣品HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprint of 20 samples

3.3 聚類分析

將上述19批西紅花花瓣烘干樣品的峰面積/干重的值導(dǎo)入SPSS 19.0軟件，如圖3所示，可將樣品大致分為2大類，分別為W7，W2，W4，W5，W3，Z4，W8，P7，W6，Z6和Z5聚為一類，這些樣品中9個(gè)特征峰的峰面積/干重的合計(jì)值排在前11位；另外一些樣品聚為一類.說明通過工藝優(yōu)化，微波干燥法、真空干燥法和普通干燥法均能有效保留樣品中有效成分的含量，樣品之間的指紋圖譜相似度良好.除了W1，微波干燥均屬于第一類，說明微波干燥對(duì)西紅花花瓣化學(xué)成分影響較穩(wěn)定，且微波干燥法的烘干時(shí)間遠(yuǎn)少于其他方法，有利于節(jié)約能源，說明微波干燥法是一種良好的西紅花花瓣干燥方法.

圖3 19批西紅花花瓣樣品平均連接樹狀圖Fig.3 Dendrogram clustering of 19 petals of Crocus sativu

4 結(jié) 論

研究了普通鼓風(fēng)干燥、真空干燥、微波干燥和冷凍干燥法對(duì)西紅花花瓣的脫水效率和化學(xué)成分含量的影響，通過比較這些樣品的HPLC指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)烘干方法和烘干參數(shù)主要是對(duì)化學(xué)成分的含量影響較大，而對(duì)化學(xué)成分的種類影響較小.結(jié)合脫水效率值，發(fā)現(xiàn)微波干燥法是一種良好的西紅花花瓣干燥方法，當(dāng)用中高火微波烘干8 min時(shí)，樣品中有效成分含量最高，該方法可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn).此外，筆者建立的西紅花花瓣HPLC指紋圖譜也為該品種質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制提供了科學(xué)依據(jù).

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