張大軍，王兆華

(吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012)

人參黃精復(fù)合飲料配方是由人參、黃精、大棗，沙棘等原料組成，是吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院研制的具有緩解體力疲勞功能的保健食品配方。經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)表明：人參黃精復(fù)合飲料可顯著延長(zhǎng)負(fù)重小鼠游泳時(shí)間；明顯降低小鼠血清尿素氮含量、顯著提高小鼠肝糖原含量、明顯減少小鼠血乳酸曲線下面積，具有緩解體力疲勞的功能 。經(jīng)配方各原料成分分析，擬定對(duì)方中大棗、黃精、沙棘三味原料采用加水煎煮提取，以活性成分環(huán)磷腺苷提取率為指標(biāo)，采用HPLC法和正交實(shí)驗(yàn)法，考察并確定了該制劑最佳水提工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

日本島津LC-10AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；SPD-10A紫外檢測(cè)器(日本島津公司)AE163電子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 試藥

環(huán)磷腺苷對(duì)照品(批號(hào)140709-201404，純度100%)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院；甲醇為色譜純，磷酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[1]

以活性成分環(huán)磷腺苷提取率為指標(biāo)，選用L9(34)正交表對(duì)加水量、煎煮時(shí)間、和煎煮次數(shù)進(jìn)行考察。因素和水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 因素和水平表

2.2 樣品測(cè)定

2.2.1 色譜條件[2]

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(5μm,4.6×250mm)；流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸(4.8：95.2)；流速：1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：259nm；柱溫：室溫。

2.2.2 樣品溶液的制備

按配方比例，稱取大棗(環(huán)磷腺苷含量為0.04%)24g，黃精12g，沙棘12g，三味原料總計(jì)48g，按表2條件進(jìn)行煎煮，合并煎液，濾過，濾液濃縮并定容至100mL，得到9份樣品溶液。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取環(huán)磷腺苷對(duì)照品適量，加蒸餾水制成每1mL含36μg的溶液，即得。

2.2.4 供試品溶液制備與測(cè)定

精密吸取”2.2.2“項(xiàng)下九份樣品溶液各5mL，置錐形瓶中，加無水乙醇15mL，搖勻，再加中性氧化鋁1g，超聲處理20min，放冷，離心(5000r/min，4min)，分取上清液，繼用75%乙醇洗滌藥渣及容器，離心，合并上清液，蒸干，殘?jiān)诱麴s水溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μL，按“2.2.1”項(xiàng)下條件，測(cè)定并計(jì)算環(huán)磷腺苷含量及提取率，測(cè)定結(jié)果見表2。

2.2.5 陰性供試品溶液制備

精密吸取缺大棗的陰性樣品溶液，按供試品溶液制備方法制備陰性供試品溶液。

2.2.6 專屬性試驗(yàn)

精密吸取上述對(duì)照品溶液、大棗陰性供試品溶液和供試品溶液各 10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果表明，供試品溶液中主要色譜峰可得以充分分離，且環(huán)磷腺苷峰形良好，陰性對(duì)照在環(huán)磷腺苷保留時(shí)間處無干擾峰出現(xiàn)，見圖 1，專屬性良好。

2.2.5 方法學(xué)考察

環(huán)磷腺苷在72～720μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=1611268.316x-13059.677，r=0.9998；取環(huán)磷腺苷對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，RSD=0.85%、吸取供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，RSD=1.64%，表明精密度良好；分別取供試品溶液，于24h內(nèi)不同時(shí)間重復(fù)進(jìn)樣6次，RSD=1.56%，表明供試品溶液至少在24h內(nèi)穩(wěn)定。

A. 環(huán)磷腺苷對(duì)照品色譜圖；B.供試品色譜圖；C陰性對(duì)照色譜圖

圖1 高效液相色譜圖

2.3 結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

表3 方差分析表

注：F0.05=19.00 F0.01=99.00；“*”表示有顯著性

從試驗(yàn)結(jié)果直觀得出，各因素影響水提效果的順序?yàn)镃(煎煮次數(shù))>A(加水量)>B(煎煮時(shí)間)；從方差分析結(jié)果得出，C(提取次數(shù))P<0.05，具有顯著性；A(加水量)、B(煎煮時(shí)間)不具有顯著性。從生產(chǎn)的實(shí)際考察，為了節(jié)省工時(shí)，節(jié)省能源，優(yōu)選煎煮工藝為A2B2C2，即加8倍量水，煎煮2次，每次1小時(shí)。

2.4 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

分別稱取100倍量配方水提原料，共3份，按照確定的優(yōu)選工藝條件A2B2C2進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 結(jié)論

通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選和工藝驗(yàn)證，確定水提最佳工藝參數(shù)為：取配方水提原料加8倍量水，煎煮2次，每次1h。在此工藝條件下進(jìn)行3次工藝驗(yàn)證試驗(yàn)，環(huán)磷腺苷提取率在70%以上，RSD=1.98%，表明該最佳工藝條件穩(wěn)定可靠，可用于人參黃精復(fù)合飲料水提原料提取。

3 討論

(1)流動(dòng)相選擇，曾采用文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)[3-4]的流動(dòng)相，在供試品色譜中環(huán)磷腺苷色譜峰與雜質(zhì)峰未能得到較好分離；后經(jīng)實(shí)驗(yàn)摸索，確定流動(dòng)相為：甲醇-0.2%磷酸(4.8：95.2)供試品中環(huán)磷腺苷色譜峰得以充分分離。

(2)在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)樣品水煎液中雜質(zhì)較多，濾過極困難。經(jīng)試驗(yàn)研究，在樣品煎煮濃縮液中加入適量無水乙醇及適量中性氧化鋁，即可除去雜質(zhì)便于濾過，又不影響環(huán)磷腺苷提取率。

[1] 王小荔，元樹艷，莫曉燕.大棗環(huán)磷酸腺苷提取純化工藝的初步研究[J] .食品科技，2012，37 (4)：190-195.

[2] 郜 文，丁兆毅，徐 菲，等.HPLC法測(cè)定大棗環(huán)磷酸腺苷(c-AMP)的含量[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32 (3)：375-378.

[3] 任玉軍，張海燕.高效液相色譜測(cè)定環(huán)磷腺苷葡胺注射液含量的方法研究[J].河北醫(yī)藥，2009，31(13)：1660-1661.

[4] 張 巖,呂 品,王 紅,等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定濃縮棗汁中環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥苷的含量[J].食品科學(xué),2009,30(18):321-322.