霍仲堅(jiān)，李婷婷，李木生，王 嬰，王 巖（廣東藥科大學(xué)，廣東廣州510006）

青藤堿（sinomenine）是從防己科植物青藤或毛青藤的藤莖中提取的生物堿單體成分，臨床常用于治療各種風(fēng)濕及類風(fēng)濕性疾病[1-2]。最新研究發(fā)現(xiàn)，除具有鎮(zhèn)痛抗炎、免疫作用外，青藤堿對各種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖也具有較強(qiáng)的抑制作用，如肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌和宮頸癌等[3-6]。青藤堿具有作用靶點(diǎn)廣、治療效果好等優(yōu)勢。但由于其生物半衰期較短，臨床治療一般需長期大劑量給藥才能使藥效持續(xù)，劑量增大后在體內(nèi)能促進(jìn)組胺釋放而致皮疹、粒細(xì)胞減少等嚴(yán)重的臨床不良反應(yīng)[7]。

長循環(huán)脂質(zhì)體是在普通納米脂質(zhì)體的處方中，加入聚乙二醇（PEG）等親水性物質(zhì)修飾其表面，經(jīng)靜脈滴注進(jìn)入體內(nèi)后，由于極性增加，可延長其在循環(huán)系統(tǒng)的滯留時(shí)間，增加消除半衰期。除了可發(fā)揮一般納米給藥系統(tǒng)對網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)豐富的器官如肝、脾、腎的靶向性以外，還可起到緩釋和降低毒性的作用。

本研究采用薄膜分散超聲法制備青藤堿長循環(huán)脂質(zhì)體，以包封率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化脂質(zhì)體的制備工藝。

1材料與方法

1.1 材料 LC-10A高效液相色譜儀（日本島津）；Diamonsil C18色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5μm）；青藤堿對照品（中國藥品生物制品檢定研究院，批號：110774-200507）；卵磷脂（上海藍(lán)季，批號：140729）；膽固醇（上海潤捷，批號：20090203）；PEG2000（天津大茂，批號：20141206B）；PEG4000（天津福晨，批號：140125）；PEG6000（天津大茂，批號：150106）。

1.2 方法

1.2.1 含量測定方法的建立

1.2.1.1液相色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合相硅膠為吸附劑，流動相為甲醇-水（25：75，用三乙胺調(diào)節(jié)pH至9.0），檢測波長為262 nm，流速為0.9 mL/min，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為20μL。理論板數(shù)按青藤堿峰計(jì)算，不得低于2 000。

1.2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取青藤堿對照品11.2 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為0.448 mg/mL的對照品溶液。

1.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密量取上述青藤堿對照品溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列對照品溶液。精密吸取20μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為0.089 6 mg/mL的青藤堿對照品溶液20μL，按上述色譜條件連續(xù)測定6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD。

1.2.1.5 包封率測定 取底部開口的微柱離心管，填入SephadexG-50葡聚糖凝膠2g，加蒸餾水浸沒，3000r/min離心5 min脫水，同法操作3次，使凝膠貼緊柱底部。精密量取青藤堿長循環(huán)脂質(zhì)體乳液1 mL，加至柱床頂端，待樣品溶液完全吸附后，加入pH7.2磷酸鹽緩沖液5 mL，3 000 r/min離心15 min，收集洗脫液，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，用無水乙醇定容，作為過柱后供試品溶液。另精密量取青藤堿長循環(huán)脂質(zhì)體乳液1 mL，置10 mL量瓶中，加無水乙醇約9 mL，超聲破乳至溶液變澄清，放冷，加無水乙醇至刻度，搖勻，作為過柱前供試品溶液。將上述兩種供試品溶液分別注入液相色譜儀，記錄峰面積，以過柱后與過柱前的峰面積比計(jì)算青藤堿的包封率[8]。

1.2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“1.2.1.5包封率測定項(xiàng)下”的同一份過柱前供試品溶液20μL，每隔2小時(shí)進(jìn)樣一次，記錄峰面積，計(jì)算RSD。

1.2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取青藤堿長循環(huán)脂質(zhì)體一批，按“1.2.1.5包封率測定項(xiàng)下”的方法平行制備6份過柱前供試品溶液，精密吸取20μL進(jìn)樣測定，計(jì)算RSD。

1.2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的青藤堿長循環(huán)脂質(zhì)體一批，按1∶1比例加入青藤堿對照品溶液，余按照“1.2.1.5包封率測定項(xiàng)下”的方法操作，測定過柱前脂質(zhì)體中青藤堿的含量，計(jì)算回收率。

1.2.2 制備工藝優(yōu)選

1.2.2.1 單因素試驗(yàn) 按處方稱取青藤堿5 mg、膽固醇10 mg、大豆卵磷脂40 mg，置50 mL茄形瓶中，加入25 mL無水乙醇溶解，在50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使其形成一層均勻薄膜，備用。另取PEG2000、PEG4000及PEG6000各2.5 mg，加入pH7.2磷酸鹽緩沖液10 mL使溶解，制成分散相。將分散相溶液加至茄形瓶中，振搖使薄膜脫落并均勻分散，轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中，超聲處理30 min，用0.45μm微孔濾膜濾過。精密量取1 mL，按照“1.2.1.5包封率測定項(xiàng)下”的方法操作，測定包封率。

1.2.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在預(yù)實(shí)驗(yàn)及參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，采用L16（4）5正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案[9-11]，以包封率為指標(biāo)，篩選藥脂比（青藤堿∶卵磷脂）、膽脂比（膽固醇∶卵磷脂）、PEG6000含量（%，處方總占比）、超聲時(shí)間（min）等四因素的適宜條件。因素水平見表1。

表1 因素水平表

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ3.1對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差和方差分析。首先根據(jù)各因素不同水平包封率均值的極差大小確定因素的主次順序。同時(shí)以誤差為參比，根據(jù)離均差平方和對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，得出優(yōu)選工藝。

2 結(jié) 果

2.1 含量測定方法學(xué)考察結(jié)果 青藤堿對照品峰面積對進(jìn)樣量的回歸方程為Y=310 641X-29 013，r=0.999 1，青藤堿在0.448～4.480μg內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。精密度測定峰面積的RSD為1.69%，表明儀器測定具有良好的精確性。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果8 h內(nèi)峰面積的RSD為2.56%，10 h后RSD則大于3.00%，峰面積逐漸呈下降趨勢，表明供試品溶液可在8 h內(nèi)保持穩(wěn)定。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果測得青藤堿含量的RSD為1.99%，結(jié)果表明本法具有良好的重復(fù)性。6批樣品的平均回收率為95.72%，RSD為2.69%，結(jié)果表明本法具有良好的準(zhǔn)確度。

2.2 制備工藝優(yōu)選結(jié)果 以PEG2000、PEG4000及PEG6000制得脂質(zhì)體的包封率分別為50.5%、46.7%、52.1%。結(jié)果表明，以PEG6000為表面修飾劑時(shí)包封率最高。

正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。由極差的大小排序可知，對青藤堿包封率影響最大的因素是藥脂比，影響最小的為PEG6000含量；方差分析結(jié)果表明，藥脂比與膽脂比對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響顯著，而PEG6000含量與超聲時(shí)間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大。青藤堿長循環(huán)脂質(zhì)體的制備條件最終確定為A3B3C1D1，即藥脂比為 1∶8，膽脂比為 1∶3，PEG6000 含量為0.25%，超聲時(shí)間為15 min。按優(yōu)選工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)3批，測得包封率為61.25%、60.17%、62.33%，表明工藝穩(wěn)定可行。

表2 正交試驗(yàn)及直觀分析結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

3 討 論

脂質(zhì)體的包封率測定方法有微柱離心法、透析法、凝膠過濾法等[12]。預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)曾對上述方法進(jìn)行了比較研究，結(jié)果三種方法測得包封率的平均值差異不大，但微柱離心法較透析法、凝膠過濾法具有更好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

在長循環(huán)脂質(zhì)體中，表面修飾劑的種類和用量主要影響脂質(zhì)體的包封率和給藥系統(tǒng)在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用不同相對分子質(zhì)量的PEG制成脂質(zhì)體的包封率差異較大，以PEG6000的結(jié)果最佳。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，PEG6000的處方用量對脂質(zhì)體的包封率無明顯影響，本實(shí)驗(yàn)暫定其用量為處方量的0.25%，該比例尚需在動物體內(nèi)的藥動學(xué)研究中進(jìn)一步確定。

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，PEG6000的處方用量對脂質(zhì)體的包封率無明顯影響，因而暫定其用量為正交設(shè)計(jì)的最小用量。

本研究采用正交試驗(yàn)法對青藤堿長循環(huán)脂質(zhì)體的制備工藝進(jìn)行了工藝優(yōu)化。所得工藝操作簡便，重復(fù)性好，包封率高。但由于制備工藝研究中僅以包封率為指標(biāo)，無法體現(xiàn)優(yōu)選工藝的體內(nèi)長循環(huán)效果，故該工藝尚需通過動物體內(nèi)的藥動學(xué)研究進(jìn)行驗(yàn)證。

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