黃 濤

(天津市兒童醫(yī)院，天津 300134)

糖腎康膠囊處方來源于臨床經(jīng)驗方，由淫羊藿、黃連、黃芪、知母、益母草和丹參等7味藥材組成，用于治療糖尿病腎病，療效顯著。有文獻報道[1，2]，黃連中的季銨型生物堿由于堿性較強，容易與黃酮類、醌類、苷類、鞣質(zhì)等成分發(fā)生化學反應而生成沉淀，同時考慮到有效成分黃連生物堿的溶解性，將黃連用乙醇單獨提取，其余水溶性成分仍沿用臨床驗方的提取方法，采用水回流進行提取的工藝路線。由于黃連的提取工藝文獻報道較多，所以本文就不再討論，本文主要研究其余6味藥材的提取純化工藝。為建立科學合理的提取純化工藝，本研究以淫羊藿苷的提取率和出膏率為考查指標，采用正交試驗設計考查各因素的影響，優(yōu)選出最佳提取工藝條件；以淫羊藿苷轉(zhuǎn)移率和除雜率為指標，采用正交試驗設計考查各因素的影響，優(yōu)選出最佳純化工藝條件，以期為糖腎康膠囊的開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

DONEX高效液相色譜儀(美國戴安)；AB204-N電子天平(萬分之一，Mettler-Toledo)；BP211D電子天平(十萬分之一，Sarlorius)；AS3120超聲波提取器(奧特塞恩思儀器有限公司)；Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱(迪馬科技)；甲醇、乙腈為色譜純(均為天津市康科德科技有限公司提供)，水為超純水，其余試劑為分析純；淫羊藿苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號10737-200312，純度：>98%，供含量測定用)；淫羊藿、黃芪、知母等藥材(安國長安中藥材有限公司，批號分別為1408001、1410001、1410003、1408009、1410006、1409001)，經(jīng)檢測符合《中國藥典》2015年版一部要求。

2 方法與結(jié)果

2.1含量測定

2.1.1色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.05 mol/L KH2PO4鹽緩沖溶液(25∶75)，流速為1.0 ml/min，檢測波長為270 nm，柱溫：35 ℃，進樣量：對照品5 μl，供試品10 μl[3]。

2.1.2溶液制備

2.1.2.1對照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷對照品適量，至25 ml量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，精密量取2 ml至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，配成每1 ml含淫羊藿苷18.13 μg的溶液。

2.1.2.2供試品溶液的制備 精密吸取水提取液1 ml置入5 ml量瓶，用超純水定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.2.3陰性對照溶液的制備 取除淫羊藿、黃連之外的其他5味藥材，按提取工藝提取，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

2.1.3系統(tǒng)適用性試驗 取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，理論塔板數(shù)以淫羊藿苷峰計算不低于3 000。淫羊藿苷與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，對稱因子在0.95～1.05之間。供試品中其他成分對淫羊藿苷的測定無干擾。結(jié)果見圖1。

2.1.4線性關(guān)系考查 精密吸取對照品溶液4、8、12、16和20 μl，按“2.1.1”項下色譜條件進行分析，測定峰面積，以峰面積對進樣量(μg)進行線性回歸，得回歸方程Y=2 646X-1.51(r=0.999 9)，結(jié)果表明淫羊藿苷在0.073～0.363 μg范圍內(nèi)，與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

1.淫羊藿苷

2.1.5含量測定 精密吸取供試品溶液、對照品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項下色譜條件測定淫羊藿苷峰面積，計算含量。

2.1.6出膏率測定 精密量取提取液5 ml，置于已于105 ℃干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，置水浴上蒸干，于105 ℃干燥至恒重，計算出膏率。

2.2正交試驗考查淫羊藿等6味中藥提取條件[4-6]

2.2.1正交試驗 依據(jù)預試驗結(jié)果，取淫羊藿等6味中藥飲片共160 g，按照正交試驗表L9(34)安排試驗，見表1。按“2.1.2.2”項下供試品溶液的制備處理，測定提取液中淫羊藿苷的含量，計算提取率，并測定出膏率。用正交設計助手Ⅱ V3.1專業(yè)版軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表2和表3。對表2中試驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理，并進行直觀分析和方差分析。以提取率為評價指標，表2中極差R值大小顯示，各因素作用主次為C>A>B，方差分析結(jié)果表明：C的影響具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，以A3B1C3組合為佳；以出膏率為評價指標時，表2中極差R值大小顯示，各因素作用主次為C>B>A，方差分析結(jié)果表明：C的影響具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，以A3B2C3組合為佳。綜合考慮生產(chǎn)周期及成本，確定最終提取工藝為A3B3C3，即加14、12、12倍量水，提取3次，1 h/次。

2.2.2工藝驗證試驗 取淫羊藿等6味中藥飲片共160 g，加入14、12、12倍量水，提取3次，1 h/次。驗證試驗平行操作3次，進行含量測定，計算提取率和出膏率，結(jié)果見表4?？梢娝_定的工藝合理可行，穩(wěn)定可靠，具有可重現(xiàn)性。

表1 提取正交試驗因素水平表

表2 提取正交試驗結(jié)果

表3 提取正交試驗方差分析表

注：F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00

表4 提取工藝驗證結(jié)果

2.3醇沉工藝[7]

2.3.1正交試驗 取淫羊藿等6味中藥的水提取液，分別濃縮至相對密度為1.10、1.15和1.20，按照正交試驗表L9(34)安排試驗，見表5。精密吸取水提醇沉液1 ml置入5 ml量瓶中，稀乙醇定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，測定醇沉液中淫羊藿苷的含量，計算醇沉轉(zhuǎn)移率，見公式1。

×100%

(公式1)

分別按“2.1.6”項下方法，測定濃縮液和醇沉液的出膏率，按照公式2計算除雜率。

×100%

(公式2)

按公式3計算總轉(zhuǎn)移率。

×100%

(公式3)

用正交設計助手Ⅱ V3.1專業(yè)版軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表6和表7。

表5 醇沉工藝正交試驗表

表6 醇沉工藝正交試驗結(jié)果

對表6中試驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理，并進行直觀分析和方差分析。以轉(zhuǎn)移率為評價指標，表6中極差R值大小顯示，各因素作用主次為B>A>C，方差分析結(jié)果表明：A、B的影響均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，以A1B3C2組合為佳；以除雜率為評價指標時，表6中極差R值大小顯示，各因素作用主次為B>A>C，方差分析結(jié)果表明：A、B的影響均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，以A3B3C1組合為佳?？紤]到轉(zhuǎn)移率評價指標的重要性，同時考慮到生產(chǎn)周期，確定醇沉工藝為A1B3C1，即相對密度1.10，醇沉至80%，醇沉12 h。

表7 醇沉工藝正交試驗方差分析表

注：F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00

2.3.2工藝驗證試驗 取淫羊藿等6味中藥水提液，減壓低溫濃縮至濃縮液密度為1.10，加95%乙醇醇沉至80%，靜置12 h，濾過，即得。驗證試驗平行操作3份，進行含量測定，計算醇沉轉(zhuǎn)移率和除雜率，并計算總轉(zhuǎn)移率和出膏率，結(jié)果見表8?？梢娝_定的工藝合理可行，穩(wěn)定可靠，具有可重現(xiàn)性。

表8 醇沉工藝驗證結(jié)果

3 討論

3.1糖腎康膠囊由淫羊藿、黃連、黃芪、知母、益母草和丹參等7味藥材組成，膠囊劑具有能掩蓋藥物的不良氣味、提高藥物的穩(wěn)定性、生物利用度高等優(yōu)點，但是膠囊劑填充量有限，若要將原方制成中藥新劑型膠囊，則需經(jīng)提取純化處理，以富集有效部位，減少服用量，同時也使患者更容易接受。由于淫羊藿等6味中藥的水提取工藝出膏率較高，制劑時較難成型，同時考慮到DM病人不宜服用含糖成分，而水提取物的糖類成分較多，故考慮利用醇沉工藝將其除去。

3.2淫羊藿、黃芪為君藥，益母草、知母、丹參等4味中藥為佐使藥，仍沿用臨床驗方的提取方法，采用水回流進行提取。由于黃芪指標成分黃芪甲苷、益母草指標成分水蘇堿、知母指標成分菝葜皂苷元的測定較為復雜，且重現(xiàn)性差，因此不將其列為考查指標。淫羊藿為方中君藥，相比丹參中指標成分丹酚酸類成分的活血作用，淫羊藿中主要指標成分淫羊藿苷具有補腎的作用，對糖尿病腎病的治療更重要，因此確定將淫羊藿苷提取率作為水回流提取的考查指標[8，9]。

3.3通過正交試驗優(yōu)選了淫羊藿等6味中藥的提取純化工藝，采用直觀分析和方差分析方法確定了最佳提取純化工藝，淫羊藿等6味中藥的水提取工藝為：加水14、12、12倍量，提取3次，每次1 h；其濃縮液醇沉工藝為：濃縮液密度1.10，加乙醇醇沉至80%，靜置12 h。按照優(yōu)選出的最佳提取純化工藝進行驗證性試驗，所得提取液的提取率均達到80%以上，穩(wěn)定性較理想，適合于工業(yè)生產(chǎn)，故此方案合理可行。

1 劉春海, 劉西京, 楊永華. 黃連及其復方提取工藝條件的優(yōu)選[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2006, 17(11): 2249-2250

2 泰延訊, 郭春景. 黃連在復方中藥制劑提取中應該注意的問題[J]. 光明中醫(yī)，2008, 23(5): 595-596

3 郭鵬, 朱雪瑜, 張鐵軍, 等. HPLC測定復方大黃顆粒中鹽酸小檗堿、淫羊藿苷及5種大黃蒽醌的含量[J].第二軍醫(yī)大學學報，2010, 31(4): 455-458

4 楊柳，鐘靜嫻,林巧玲,等.淫羊藿中淫羊藿苷的提取工藝研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2005，16(4):293

5 牟嬋,周若鵬,賴瀅瀅.正交試驗法優(yōu)選復方淫羊藿咀嚼片的提取工藝[J].中國藥房, 2015, 26(28): 3986-3988

6 張華峰, 楊曉華. 淫羊藿黃酮類化合物提取研究進展[J]. 中藥材,2010, 33(3): 470-474

7 馮青然, 王元瑜, 馬振山, 等. 中藥水煎煮液分離、純化工藝的比較研究[J]. 中國中藥雜志, 2002, 27(1): 28-30

8 楊敏. 中藥藥對治療糖尿病腎病臨證擷菁[J]. 遼寧中醫(yī), 2006, 33(4):462-463

9 錢虹, 楊鈞杰, 潘定一, 等. 淫羊藿總黃酮對實驗性糖尿病大鼠腎臟保護作用[J]. 中國應用生理學, 2014, 30(4):314-317