□ 付偉超 商丘市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心

1 分子生物學(xué)方法

1.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）作為常見的一種分子生物學(xué)技術(shù)，其是在體外對特定的DNA片斷進(jìn)行放大擴(kuò)增，然后對其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。在食品致病菌檢測領(lǐng)域，使用PCR技術(shù)對特異DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增從而快速地檢測食品中的致病菌，能夠同時分析多種致病性微生物，且速度快、靈敏度高，尤其適合人工無法培養(yǎng)或者培養(yǎng)難度較大的微生物。PCR技術(shù)雖然具有高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，但是由于其存在技術(shù)缺陷，還不能從根本上替代常規(guī)的檢測方法。首先是假陽性和假陰性問題，核酸污染是造成假陽性的主要原因，食品中復(fù)雜的成分能夠抑制PCR反應(yīng)導(dǎo)致假陰性。其次就是定量檢測較為困難。因此，這也限制了PCR技術(shù)在致病菌檢測中的推廣使用。

1.2 基因芯片（Genechip）技術(shù)

作為一種大規(guī)模、高通量核酸分子雜交測序方法，基因芯片通過微加工技術(shù)將一系列已知次序探針固定于支持物表面，形成高密度的寡核苷酸陣列，被測食品樣品經(jīng)核酸提取、PCR擴(kuò)增及標(biāo)記后與芯片上的探針陣列產(chǎn)生互補(bǔ)匹配時，熒光掃描或酶聯(lián)免疫反應(yīng)后，依據(jù)雜交信號情況，最終定性或定量檢測食品樣品中的致病菌情況。由于該技術(shù)具有大規(guī)模、高通量、簡單化的特點(diǎn)，在食品安全快檢中使用廣泛。李君文等建立了分辨率為5.2×107 CFU/ mL的水體中致病性微生物的快速檢測方法。Call等通過分析大腸桿菌O157:H7的志賀樣毒素Ⅰ和Ⅱ以及溶血素A，得出了基因芯片技術(shù)可定性檢測各種大腸桿菌O157:H7分離物的結(jié)論。由于基因芯片技術(shù)還處于科研階段，還需要不斷改進(jìn)，存在樣品制備過程復(fù)雜、檢測儀器成本高、檢測特異性差、有假陽性的情況，以及基因組學(xué)資源庫相對匱乏、標(biāo)準(zhǔn)化程序建設(shè)困難等技術(shù)問題亟待解決。

1.3 核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)是根據(jù)堿基配對的原理，將目標(biāo)菌特異基因中的一條鏈標(biāo)記成核酸探針，通過檢測被檢樣品與標(biāo)記的核酸探針能否形成雜交分子，最終判斷被檢食品樣品是否污染該目標(biāo)致病菌。依據(jù)放射性強(qiáng)度定量檢測食品中致病菌的量。核酸探針檢測致病菌用時較短，且特異性、靈敏度高。

隨著核酸探針技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，其在致病菌檢測領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越廣泛，另外，新的非放射性基因探針、DNA生物傳感器探針、分子信標(biāo)探針等技術(shù)也取得了一定的突破。目前，沙門氏菌、志賀氏菌、單增李斯特菌等常見致病菌均可采用該技術(shù)進(jìn)行定性和定量分析。

2 免疫學(xué)技術(shù)

免疫學(xué)應(yīng)用技術(shù)主要有酶聯(lián)免疫技術(shù)、免疫磁珠技術(shù)、熒光抗體及乳膠凝集技術(shù)等，其基本原理是在反應(yīng)體系中通過人工標(biāo)記，借助抗體或抗原在體外發(fā)生特異性反應(yīng)結(jié)合后出現(xiàn)的顯色、熒等各種現(xiàn)象，從而定性或定量檢測被測樣品中的微量物質(zhì)。

金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、致病性大腸桿菌以及單增李斯特氏菌等多種食源致病菌可以通過免疫磁性微球技術(shù)進(jìn)行分析檢測。該技術(shù)具有精度高、效率高的特點(diǎn)，但是抗體的制備要提前進(jìn)行，經(jīng)濟(jì)性不高。

早期分析植物病毒的酶聯(lián)免疫技術(shù)，目前已被廣泛應(yīng)用在疾病診斷、人體細(xì)菌感染判斷、動物源食品抗生素殘留檢測等領(lǐng)域。酶聯(lián)免疫技術(shù)具有靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，由于其抗原、抗體容易受環(huán)境因素的影響而發(fā)生變化，所以穩(wěn)定性和重現(xiàn)性不強(qiáng)，對儲存和反應(yīng)環(huán)境要求較高，在實(shí)際檢測應(yīng)用過程中會有假陽性的情況出現(xiàn)。目前，酶聯(lián)免疫技術(shù)在致病性細(xì)菌腸毒素檢測中應(yīng)用較多，對感染傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌和單增李斯特氏菌的食品也能進(jìn)行快速檢測，從而提高了致病菌檢驗(yàn)的效率。

乳膠凝集技術(shù)作為免疫學(xué)技術(shù)的一種，其基本原理是乳膠顆粒作為載體，特異性抗體與之結(jié)合后，產(chǎn)生凝集反應(yīng)，根據(jù)是否發(fā)生凝集反應(yīng)，從而判斷食品是否污染致病菌。目前，在沙門氏菌、葡萄球菌、軍團(tuán)菌、鏈球菌、李斯特氏菌等致病菌檢測方面均有應(yīng)用。該技術(shù)具有準(zhǔn)確、快速、簡便、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，但是在環(huán)境條件發(fā)生改變時，會產(chǎn)生凝集，靈敏度下降。

3 蛋白組學(xué)技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)是生命科學(xué)研究領(lǐng)域非常重要的工具，也是定性和定量檢測食品中致病菌的理論基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)譜和基因圖譜技術(shù)的延伸，蛋白質(zhì)的分離、鑒定和檢測是蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)。由于每種細(xì)菌的飛行時間質(zhì)譜圖都具有特異性，因此，可以利用這一特性通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）進(jìn)行致病性微生物屬種甚至種內(nèi)的監(jiān)督，從而彌補(bǔ)以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)檢測方法的缺陷，且具有效率高、節(jié)省成本且靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。將來在食品致病菌和腐敗菌檢測方面具有良好的應(yīng)用前景。在最近幾年，利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定食品中致病菌的報(bào)道也在逐年增加。周千渝等建立了蔬菜中出血性大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌基于MALDI-TOF MS法的快速檢測方法。

未來，蛋白質(zhì)組學(xué)與基因組學(xué)、代謝組學(xué)的結(jié)合研究會是食品致病菌快速檢測的重要方向。

4 生物傳感器技術(shù)

生物傳感器是一種分析目標(biāo)化合物的裝置，由生物識別元件和信號轉(zhuǎn)換元件組成，由傳統(tǒng)的物理傳感器發(fā)展而來。生物傳感器具有抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn)，具有吸收、反射、化學(xué)發(fā)光、熒光等多種檢測模式。生物傳感器技術(shù)為微生物檢驗(yàn)帶來了極大的便利，同時，也使食品工業(yè)自動在線檢測成為可能。Liu Y等人用光學(xué)免疫傳感器建立了可以在2 h內(nèi)完成鼠傷寒沙門氏菌快速檢測的方法。葉雪梅等研制了可定量檢測實(shí)際溶液中沙門氏菌濃度的磁致伸縮生物傳感器，對其在不同溫度條件下的持久性進(jìn)行了探討。王一嫻以大腸桿菌O157:H7為研究對象，在表面等離子體共振生物傳感方法和電化學(xué)阻抗譜生物傳感法兩種生物傳感法的基礎(chǔ)上，利用新型生物識別分子和納米材料建立了大腸桿菌O157:H7快速檢測方法，同時，還結(jié)合儀器分析技術(shù)，開發(fā)了便攜式用于現(xiàn)場大腸桿菌O157:H7快速檢測的平臺。加拿大魁北克大學(xué)光子學(xué)研究中心研制出的一種新型傳感器可以在15～20 min內(nèi)定量檢測出受污染的水或食物中的致病性大腸桿菌，且該傳感器對溫度不敏感。

食品中致病菌檢測的傳感器應(yīng)用成熟、種類多，出現(xiàn)了很多商品化傳感器，但是還存在著檢出限低、檢測結(jié)果準(zhǔn)確度不高等問題需要解決。

5 結(jié)語

近年來，世界各國對食品安全問題的重視，使食品中致病菌快檢技術(shù)的需求不斷提升。食品中致病菌快檢技術(shù)也得到了快速的發(fā)展，各種各樣的快檢技術(shù)不斷出現(xiàn)，成為食品安全檢測和監(jiān)管的有力工具，為食品工業(yè)更好更快發(fā)展提供了保障。任何一種檢測技術(shù)都有優(yōu)缺點(diǎn)，未來微生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)、分析化學(xué)等多學(xué)科的互相交叉滲透，研發(fā)更靈敏、更搞笑、更實(shí)用的食品致病菌檢測技術(shù)將會是快速檢測的發(fā)展方向。