潘紅燕

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310008）

肺癌是中國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，由于缺乏可靠的早期診斷方法，約60%～80%的肺癌患者確診時已屬晚期，喪失了手術(shù)治療的機(jī)會，再加上肺癌容易發(fā)生耐藥和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致十年來肺癌的總體存活率并沒有得到顯著增加，是當(dāng)今社會嚴(yán)重威脅人類健康的主要因素之一[1]。雖然腫瘤組織活檢仍然是肺癌診斷和獲取腫瘤細(xì)胞遺傳變異的首要途徑，但組織活檢存在著不少局限性，主要為：不少晚期肺癌患者無法進(jìn)行組織活檢；腫瘤的異質(zhì)性導(dǎo)致穿刺組織無法全面反映腫瘤的整體信息；穿刺活檢可能造成較大的醫(yī)療風(fēng)險等[2]。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)系統(tǒng)中存在的腫瘤遺傳物質(zhì)可以為腫瘤的早期診斷、基因分型提供可靠的信息，可以有效地彌補(bǔ)腫瘤組織活檢的不足，這種從血液中獲取腫瘤細(xì)胞遺傳變異的途徑我們稱之為“液體活檢”。液體活檢的優(yōu)勢在于能夠通過非侵入性取樣降低活檢的不良反應(yīng)，因此可以進(jìn)行重復(fù)檢測，動態(tài)地觀察患者疾病的進(jìn)展，對治療反應(yīng)進(jìn)行實時監(jiān)測[3]。

液體活檢技術(shù)中最常見的獲取腫瘤DNA的來源有三種：循環(huán)腫瘤DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）[4]、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cells ，CTCs）[5]以及外泌體（Exosomes）[6]。ctDNA是游離于血液中的小片段核酸，而循環(huán)腫瘤細(xì)胞是游離于血液中的可被捕獲的完整腫瘤活細(xì)胞，外泌體是細(xì)胞外包含DNA、RNA、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物等物質(zhì)的小囊泡，也可被當(dāng)做腫瘤的分子標(biāo)記物，下文分別對ctDNA、CTCs和外泌體在肺癌分子診斷中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1.ctDNA在肺癌分子診斷中的研究進(jìn)展

ctDNA是指腫瘤細(xì)胞因壞死或凋亡而掉落的腫瘤DNA片段，由Mandel和Metais于1940年率先提出，ctDNA會隨著血液循環(huán)系統(tǒng)不斷地流動，可以反應(yīng)腫瘤基因突變、缺失、重排、甲基化等信息[7]。在腫瘤患者中，ctDNA的含量要比正常人更高[8]。由于在腫瘤形成早期血液中還沒有CTCs時就已經(jīng)能檢測到ctDNA，因此ctDNA液體活檢技術(shù)在腫瘤分子診斷中的價值大于CTCs，特別是可以通過檢測ctDNA而發(fā)現(xiàn)早期的腫瘤。研究表明，Ⅱ～Ⅳ期的非小細(xì)胞肺癌患者ctDNA的檢出率為100%，但是在Ⅰ期，僅有50%的患者被檢出[9]。目前，ctDNA液體活檢技術(shù)在肺癌分子診斷中已有較為廣泛的應(yīng)用，最常見的應(yīng)用是血液EGFR基因突變狀態(tài)的檢測，特別是非小細(xì)胞肺癌患者接受靶向治療過程中耐藥突變T790M的檢測，T790M突變同時也是第三代靶向EGFR的TKI抑制劑藥物檢測靶點[10]。目前，F(xiàn)DA與中國國家食品藥品監(jiān)督管理總局已批準(zhǔn)了多款針對ctDNA的肺癌靶向藥物伴隨診斷試劑盒，例如廈門艾德生物科技股份有限公司基于superARMS技術(shù)的血液EGFR基因突變檢測試劑盒、羅氏診斷開發(fā)的Cobas EGFR Mutation Test V2試劑盒等。

2.CTCs在肺癌分子診斷中的研究進(jìn)展

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cells，CTCs）是原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞脫落進(jìn)入外周血循環(huán)系統(tǒng)的游離腫瘤細(xì)胞，具有較強(qiáng)的流動性與侵襲性，容易粘附至血管壁并穿越，是惡性腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的主要途徑之一[11]。雖然有些CTCs在脫落過程中經(jīng)歷過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，但包含了原發(fā)灶腫瘤主要的細(xì)胞表型和細(xì)胞遺傳變異，因此，CTCs可以成為液體活檢技術(shù)獲取腫瘤信息的有效途徑之一。CTCs的捕獲技術(shù)近年來發(fā)展較為迅速，主要捕獲策略有免疫磁珠捕獲技術(shù)、微流控技術(shù)、濾膜分離技術(shù)等[12]。CellSearch系統(tǒng)是全球第一個也是唯一經(jīng)過美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）和中國國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)，用于惡性腫瘤疾病輔助診斷的檢測CTC的產(chǎn)品。但其應(yīng)用領(lǐng)域僅限于乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌，在肺癌中其檢測特異性和靈敏度均不理想，由于價格昂貴以及不能用于下游的細(xì)胞培養(yǎng)、基因檢測等限制，強(qiáng)生公司在2016年初已經(jīng)宣布停止銷售，Cell search作為腫瘤領(lǐng)域無創(chuàng)診斷的先行者，雖然還存在著不少缺陷，卻開辟了CTCs無創(chuàng)檢查的新方向。隨著未來CTCs捕獲技術(shù)的進(jìn)步，相信未來CTCs領(lǐng)域會產(chǎn)生更大影響力的創(chuàng)新無創(chuàng)液體活檢產(chǎn)品。

3.外泌體在肺癌分子診斷中的研究進(jìn)展

近年來，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者外周血中的外泌體是一種新型的腫瘤生物標(biāo)記物。外泌體是由細(xì)胞釋放至血液中的具有完整包膜包含著母體細(xì)胞多種核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的小囊泡，直徑大約為30～100nm[13]。外泌體是細(xì)胞與遠(yuǎn)處細(xì)胞之間信息交流的介質(zhì)，因此可以在多種體液例如血液、尿液等中被檢測到。由于外泌體可以反應(yīng)母細(xì)胞中的遺傳變異、代謝狀態(tài)、生物標(biāo)記物等，因此，目前以有針對外泌體而開發(fā)的液體活檢檢測技術(shù)，用于檢測肺癌細(xì)胞中EGFR基因突變、EML4-ALK基因融合等，由于外泌體具有完整的包膜并來源于活細(xì)胞，因此相比于ctDNA而言外泌體液體活檢展現(xiàn)出了較強(qiáng)的優(yōu)勢，特別是在腫瘤RNA的檢測中優(yōu)勢顯著[14]。然而幾乎所有類型細(xì)胞都會分泌外泌體，不僅僅是腫瘤細(xì)胞，因此，外泌體的分離和檢測技術(shù)還有待于進(jìn)一步的完善。目前，美國Exosome Diagnostics公司針對外泌體RNA已經(jīng)開發(fā)了肺癌的血液檢測試劑盒。

4.總結(jié)與展望

隨著液體活檢技術(shù)的進(jìn)步，早期肺癌的篩查已經(jīng)出現(xiàn)了曙光。相比于影像學(xué)和傳統(tǒng)的組織活檢，液體活檢技術(shù)在微創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用性方面展現(xiàn)出了較強(qiáng)的優(yōu)勢，但目前為止各種技術(shù)都還存在著不少問題，未來液體活檢技術(shù)將在肺癌診斷、監(jiān)測領(lǐng)域起到更加重要的作用。

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