陳清閣 王雄彪(通訊作者)

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院呼吸科 上海 200062）

B7H3作為重要的抑制性共刺激分子，其高表達(dá)抑制了T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫活性，造成腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。B7H3的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期明顯相關(guān)，是一個(gè)重要的肺癌治療靶點(diǎn)。Pra-C是中藥前胡中重要提取物之一，本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)Pra-C對(duì)人肺癌A549細(xì)胞B7H3表達(dá)、基因水平的調(diào)節(jié)，探討Pra-C對(duì)共刺激分子B7H3的調(diào)節(jié)作用。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來源及培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞A549由上海中國(guó)科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)提供，常規(guī)培養(yǎng)于雙抗和10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco）；Pra-C（成都曼徹斯特）；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒（Promega）；B7H3引物與探針（閃晶），ABI7300全自動(dòng)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）等。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞術(shù) A549細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于24孔板，加藥48h后分別收集于流式細(xì)胞管中，清洗后調(diào)整每管體積為50μL；加入B7H3-PE抗體5μL，4℃避光30min；加300μL D-Hanks緩沖液，上機(jī)。

1.2.2 Real-Time PCR 反應(yīng)條件：94℃ 10min，94℃ 30s，60℃ 1min，40個(gè)循環(huán)，以GAPDH基因作為內(nèi)參，引物序列如下：B3H3-F5’-GTGGTGCTGGGTGCAAT-3’；B3H3-R5’-CCTCTGGGGGGAATGTCATA-3’；B3H3-probe 5’-GTGGTGCTGGGTGCAAT-3’；GAPDH-F 5’-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3’；GAPDH–R5’-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3’；GAPDH-probe 5’-TTGCCCTCAACGACCACTTTGTC-3’

1.2.3 B7H3-PGL3報(bào)告基因的構(gòu)建 設(shè)計(jì)人B7H3啟動(dòng)子引物，B7H3-F5’-gcGGTACCCGGTTCCTCCCTTCATAGC-3’；B7H3-R CCTGAGTCCCAGAGTCG；擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1240bp，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選克隆，測(cè)序結(jié)果正確后樣本質(zhì)粒提取。

1.2.4 熒光素酶實(shí)驗(yàn) 將B7H3-PGL3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，分為Pra-C40μmol/ml組、IFN-γ組、空白對(duì)照組，24小時(shí)后，GloMax20/20發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用SNK-q檢驗(yàn)比較多組間差異，計(jì)量資料采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間差異，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 Pra-C可以下調(diào)A549細(xì)胞B7H3蛋白的表達(dá)

SNK-q檢驗(yàn)不同處理組間A549細(xì)胞B7H3蛋白的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)Pra-C濃度在40μmol/ml、20μmol/ml、10μmol/ml時(shí)B7H3蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為（0.235±0.01）（0.38±0.009）（0.43±0.004），其下調(diào)作用具有劑量依賴性，Pra-C濃度在40μmol/ml時(shí)與50ng/ml IFN-γ對(duì)A549細(xì)胞B7H3蛋白的下調(diào)作用無顯著差異（P=0.054）。

2.2 Pra-C可以下調(diào)A549細(xì)胞B7H3 mRNA的表達(dá)

Real-Time PCR結(jié)果顯示，40μmol/ml Pra-C組及50ng/ml IFN-γ組作用于A549細(xì)胞24h后均可顯著下調(diào)A549細(xì)胞B7H3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平(分別是0.712±0.17，0.726±0.15，P=0.017,P=0.005)，且兩組之間無顯著差異，（t=-0.115，P=0.913）

2.3 Pra-C對(duì)B7H3-PGL3-promoter熒光報(bào)告基因的調(diào)節(jié)

熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同處理組B7H3相對(duì)熒光強(qiáng)度：40μmol/ml 與IFN-γ組均可顯著下調(diào)A549細(xì)胞B7H3啟動(dòng)子轉(zhuǎn) 錄（ 分 別 是 0.236±0.15，0.257±0.002，P＜0.001）， 且Pra-C與INF-γ對(duì)B7H3的調(diào)節(jié)作用無顯著差異（t=-2.628，P=0.054）。

3.討論

肺癌是當(dāng)今全世界發(fā)生率和死亡率最高的惡性腫瘤。由APC細(xì)胞表面的多種共刺激分子與T細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，可以決定接受抗原刺激的T細(xì)胞是活化增殖，還是抑制甚至凋亡。B7H3作為重要的抑制性共刺激分子，其高表達(dá)抑制了T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫活性，造成腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，可成為肺癌治療的靶點(diǎn)。

已有研究顯示，50ng/ml IFN-γ可下調(diào)人肺癌細(xì)胞A549表面B7H3的表達(dá)。本研究用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)、RT-PCR技術(shù)、雙熒光素酶法分別檢測(cè)B7H3蛋白表達(dá)水平、轉(zhuǎn)錄水平及啟動(dòng)子區(qū)的調(diào)節(jié)水平。結(jié)果顯示，當(dāng)Pra-C濃度為40μmol/ml時(shí)下調(diào)作用最強(qiáng)，較50ng/ml IFN-γ無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Pra-C是前胡重要的香豆素類化合物提取物之一。前胡作為呼吸疾病常用藥物，具有降氣化痰、疏散風(fēng)熱之功，探討Pra-C通過免疫調(diào)節(jié)作用發(fā)揮抗腫瘤療效對(duì)拓展中草藥前胡在抗腫瘤領(lǐng)域的思路有一定價(jià)值。

[1]劉一誠(chéng)，戴彭辰，李慧英，騰柱國(guó)，何成詩(shī).共刺激因子B7H3在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)研究.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016,16(27):5309-531.

[2]趙建強(qiáng)，孫玉萍，王薇，等.B7H3分子在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的研究.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2008,11(1A):31-34.