鄭細(xì)閏，劉 影，張志發(fā)，李楚天，何青蓮，鄭廣娟

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)在甲狀腺癌中發(fā)生率最高，約占85%[1]。PTC術(shù)后10年生存率可達(dá)90%以上，其預(yù)后雖良好，但尚有少部分PTC患者因腫瘤具有較強(qiáng)的侵襲性而不易完整切除，從而導(dǎo)致病情遷延或疾病復(fù)發(fā)[2]，因此預(yù)后判斷與合理的干預(yù)措施對PTC的治療有重要意義。研究表明，B-raf基因V600E突變與PTC的臨床病理特征相關(guān)[3]，且近年針對B-raf基因V600E突變的分子靶向藥物(如Vemurafenib)備受關(guān)注[4]，B-raf基因V600E突變在PTC患者中發(fā)生率為28%～83%[5]。因此，對PTC患者行B-raf基因V600E突變檢測具有較好的臨床指導(dǎo)意義。本文現(xiàn)從操作流程、檢測結(jié)果等方面對術(shù)中冷凍病理組織和石蠟包埋組織兩種來源的DNA提取方法進(jìn)行比較，以確定臨床B-raf基因V600E突變更快捷、更準(zhǔn)確的檢測方法，為PTC患者提供更優(yōu)質(zhì)的服務(wù)。

1 材料與方法

1.1材料選取2016年4～6月廣東省中醫(yī)院病理科大學(xué)城醫(yī)院術(shù)中冷凍病理診斷為PTC的20例患者作為分析對象，分別于術(shù)中取其冷凍切片10張(切片5 μm厚)和術(shù)后第2天取同一病理號的石蠟包埋組織切片10張(切片5 μm厚)，同時對冷凍和石蠟切片進(jìn)行HE染色，劃取腫瘤細(xì)胞富集區(qū)域，并進(jìn)行腫瘤細(xì)胞DNA提取。

1.2儀器試劑全自動冷凍切片機(jī)、超微量分光光度計ND-8000、全自動組織脫水機(jī)(Thermo Scientific公司)；石蠟包埋組織切片機(jī)(Leica公司)；全自動染色機(jī)(Leica公司)；DNA提取試劑盒(寶創(chuàng)生物公司)；生物安全柜(阿爾泰實驗室設(shè)備公司)；超凈工作臺(蘇潔凈化設(shè)備公司)；人類B-raf基因V600E突變檢測試劑盒(武漢海吉力公司)；RT-PCR檢測儀(ABI公司)；水平電泳儀(Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Cambridge公司)。

1.3DNA提取為了防止交叉污染，每一個冷凍病理組織和石蠟包埋組織在實驗過程中均嚴(yán)格控制提取條件。切片時確保每塊組織使用新的刀片，周圍沒有其他組織的廢屑，將切片貼于未使用過的載玻片上；固定和脫蠟時，確保對每一個組織單獨進(jìn)行固定和脫蠟，固定液和脫蠟液不重復(fù)、不交叉使用；PCR實驗室分為試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、PCR擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)，DNA的提取在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，使用一次性已滅菌無核酸酶的潔凈吸頭；PCR加樣在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，操作整個過程確保每個標(biāo)本標(biāo)記準(zhǔn)確，無交叉混淆現(xiàn)象。

1.3.1冷凍病理組織DNA提取 將冷凍切片放置于95%乙醇固定液中固定10 min，再置蒸餾水中5 min復(fù)水，轉(zhuǎn)移至裝超純水的小燒杯，采用Biotron DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，具體操作步驟如下：根據(jù)術(shù)中冷凍HE切片染色結(jié)果，將腫瘤細(xì)胞富集區(qū)域刮取下來，放于裝有200 μL ATL的1.5 mL EP管中，然后加入20 μL蛋白酶混合液，吹打混勻；于56 ℃水浴1～3 h或直至組織被消化完全(也可消化過夜)；取出向離心管中加入200 μL變性液AL和200 μL無水乙醇，渦旋混勻后短暫離心；將吸附柱裝在收集管中，轉(zhuǎn)移混合液至吸附柱，10 000g離心1 min；倒棄濾液，把柱子裝回收集管中，加入500 μL洗滌液GW1至吸附柱中，10 000g離心1 min；倒棄濾液，把柱子裝回收集管中，加入650 μL洗滌液GW2至吸附柱中，10 000g離心1 min；倒棄濾液，把柱子裝回收集管中，10 000g離心空柱3 min；將吸附柱轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中，加入65 μL洗脫液EB至吸附柱的膜中央，靜置1 min，10 000g離心1 min；丟棄DNA吸附柱，應(yīng)用ND-8000超微量分光光度計對提取的DNA進(jìn)行濃度及質(zhì)量測定，其符合標(biāo)準(zhǔn)為1.7< OD260/OD280<2.1，濃度超過100 ng/μL的標(biāo)本須將濃度稀釋到100 ng/μL保存。

1.3.2石蠟包埋組織DNA提取 將石蠟切片按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行脫蠟，具體過程：二甲苯Ⅰ 10 min、二甲苯Ⅱ 10 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、95%乙醇 5 min、80%乙醇 5 min、70%乙醇5 min、蒸餾水5 min，合計約1 h。采用Biotron DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，具體操作步驟基本與冷凍切片DNA提取法相同，另需將56 ℃水浴后的標(biāo)本置于90 ℃繼續(xù)水浴1 h。

1.4DNA質(zhì)量鑒定將冷凍病理組織和石蠟包埋組織提取的DNA分別進(jìn)行質(zhì)量鑒定，另取血液提取同樣濃度DNA標(biāo)本1例作為陽性對照，DNA洗脫液EB作為陰性對照。分別取5 μL基因組DNA與1 μL 6×Loading Buffer混勻，在1.0%的瓊脂糖凝膠孔中進(jìn)行點樣，同時加5 μL Marker進(jìn)行標(biāo)記，電泳條件為80 V 60 min。最后在紫外凝膠成像系統(tǒng)下分析電泳結(jié)果。

1.5RT-PCR檢測B-raf基因V600E突變采用武漢海吉力公司的人類B-raf基因V600E突變檢測試劑盒進(jìn)行RT-PCR檢測，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。每孔DNA上樣量為6 ng，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，1個循環(huán)；95 ℃ 20 s，62 ℃ 20 s，合計15個循環(huán)；95 ℃ 20 s，60 ℃ 40 s，合計31個循環(huán)；60 ℃時收集突變信號FAM和內(nèi)參信號VIC。V600E突變陽性結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：FAM信號CT值為11～26，且ΔCT值≤6。

2 結(jié)果

2.1兩種方法提取的基因組DNA質(zhì)量對比瓊脂糖凝膠電泳圖顯示，20例石蠟包埋組織提取的基因組DNA均較冷凍病理組織提取的DNA降解嚴(yán)重，質(zhì)量相對較差(圖1)。兩種方法所得DNA的A260/A280值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖

A.20例石蠟包埋組織DNA；B.20例術(shù)中冷凍病理組織DNA；陰性對照為Elute Buffer，陽性對照為血液gDNA

表1 兩種方法提取DNA A260/A280值比較

2.2兩種方法RT-PCR檢測比較20例標(biāo)本B-raf基因V600E突變檢測結(jié)果完全一致，其中檢測陽性共突變15例，比較15例陽性標(biāo)本的FAM、VIC信號的CT值和兩者的ΔCT值，可以發(fā)現(xiàn)冷凍病理組織的FAM和VIC信號的CT值均小于石蠟包埋組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩種方法所得陽性結(jié)果的ΔCT值，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2 兩種方法RT-PCR檢測結(jié)果對比

與石蠟包埋組織相比，*P<0.05

3 討論

在科技發(fā)展技術(shù)日益革新的今天，速度是醫(yī)學(xué)技術(shù)提升的主要切入點。從石蠟包埋組織中提取DNA是目前臨床研究常用手段，其操作簡便，實用性強(qiáng)，但是石蠟組織中提取的DNA降解嚴(yán)重[6]，這對臨床即時檢測提出新的思考。本實驗提出術(shù)中冷凍病理組織提取DNA的操作方法，實驗證明術(shù)中冷凍病理組織提取DNA可在發(fā)布冷凍報告后2 h內(nèi)得到DNA，3.5 h內(nèi)檢測完畢并完成臨床報告，而石蠟包埋組織還需等到第2個工作日將蠟塊包埋好再進(jìn)行脫蠟、提取，常規(guī)脫蠟需1 h且提取過程中需進(jìn)行90 ℃水浴解除福爾馬林固定導(dǎo)致的DNA與蛋白質(zhì)產(chǎn)生的交聯(lián)，耗費時間長。

此外，凝膠電泳和RT-PCR檢測內(nèi)參信號VIC值的結(jié)果均顯示，與石蠟包埋組織DNA相比，術(shù)中冷凍病理組織提取的DNA完整性更好，質(zhì)量更高。本實驗結(jié)果顯示：從術(shù)中冷凍病理組織中提取DNA可顯著縮短臨床檢測B-raf基因V600E突變的時間，且DNA質(zhì)量更優(yōu)，因此使用該方法可以更快捷、更準(zhǔn)確的為臨床服務(wù)。

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