劉 芳，趙秀蘭，孫保存,2，墨 晶，林 賢，董學(xué)易

隨著腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)的提出，一些惡性腫瘤在放、化療后遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及傳統(tǒng)化療藥物無(wú)法根治的現(xiàn)象得到了很好地解釋，同時(shí)為癌癥的靶向治療提供新的思路。因此，近幾年來(lái)腫瘤干細(xì)胞的研究成為熱點(diǎn)，富集腫瘤干細(xì)胞并保持其干性的培養(yǎng)方法是技術(shù)關(guān)鍵。Weiswald等[1]總結(jié)的4種體外三維培養(yǎng)模型中有2種適合腫瘤干細(xì)胞球培養(yǎng)：無(wú)血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)法、瓊脂或瓊脂糖表面含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)法。本實(shí)驗(yàn)著重探討兩種腫瘤干細(xì)胞球培養(yǎng)方法的優(yōu)劣，為完善腫瘤干細(xì)胞球培養(yǎng)技術(shù)提供思路。

1 材料與方法

1.1材料黑色素瘤B16/F10，購(gòu)自北京協(xié)和組織細(xì)胞庫(kù)。RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自北京鈕因泰克公司；干細(xì)胞誘導(dǎo)因子B27購(gòu)自Invitrogen公司，表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)購(gòu)自 Pepro Tech 公司；抗體CD133購(gòu)自Biorbyt公司。

1.2方法

1.2.1黑色素瘤干細(xì)胞球培養(yǎng) (1)無(wú)血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)法：將正常培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16/F10細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以2×104個(gè)/孔的密度接種于超低吸附劑poly-hema包被的6孔板中，每孔2 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基，加入B27濃度為20 μL/mL，bFGF濃度為20 ng/mL，EGF濃度為20 ng/mL。在37 ℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)，每隔3～4天換液，每隔7～8天傳代；顯微鏡下觀察細(xì)胞成球情況和形態(tài)。實(shí)驗(yàn)取第三代細(xì)胞球。(2)瓊脂上含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)法：將正常培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16/F10細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液以2×104個(gè)/孔的密度接種于0.5%瓊脂包被的6孔板中，每孔2 mL培養(yǎng)液，為含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液，在37 ℃5%CO2條件下培養(yǎng)，每隔3～4天換液，每隔7～8天傳代；在顯微鏡下觀察細(xì)胞成球情況和形態(tài)。實(shí)驗(yàn)取第三代細(xì)胞球。

1.2.2干細(xì)胞球蠟塊、切片的制備 將干細(xì)胞球收集于離心管中，自然沉淀后棄上清，經(jīng)10%中性福爾馬林固定過(guò)夜，細(xì)胞球經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋等過(guò)程，最后制成石蠟塊[2]，制成4 μm厚石蠟切片。

1.2.3免疫組化染色 免疫組化染色采用SP法，常規(guī)進(jìn)行二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、用3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，抗原修復(fù)采用微波修復(fù)的方式，時(shí)間為10 min，山羊血清封閉后滴加一抗CD133，濃度為1 ∶100，4 ℃冰箱過(guò)夜，次日滴加山羊抗兔二抗、DAB顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封固，顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并拍照。組織中陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)為棕黃色或黃褐色，每例標(biāo)本選擇含陽(yáng)性細(xì)胞的10個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞中所占百分率的均值。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞球形態(tài)差異從培養(yǎng)過(guò)程中觀察發(fā)現(xiàn)無(wú)血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)法在培養(yǎng)過(guò)程中，尤其是第一代培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)，大量細(xì)胞死亡，少數(shù)細(xì)胞增殖成球，隨著傳代次數(shù)增加，死亡的細(xì)胞數(shù)大量減少，細(xì)胞球成球速度增快，數(shù)量增多，細(xì)胞球結(jié)構(gòu)更加緊密。瓊脂上完全培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)生死亡的細(xì)胞數(shù)量較少，隨著傳代次數(shù)增加，變化并不明顯，成球速度等方面變化也同樣不明顯。

從細(xì)胞球的形態(tài)上觀察發(fā)現(xiàn)，無(wú)血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)法培養(yǎng)的細(xì)胞球比較規(guī)則，結(jié)構(gòu)緊密的球體(圖1A)；瓊脂上完全培養(yǎng)基培養(yǎng)法培養(yǎng)的細(xì)胞球在形態(tài)上與之存在較大的差異，尤其是第一代細(xì)胞球的形成比較傾向于由細(xì)胞粘連而成，結(jié)構(gòu)疏松，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞球間粘連嚴(yán)重(圖1B)。隨著傳代次數(shù)增加細(xì)胞球形態(tài)較為規(guī)則(圖1C)，到第三代已無(wú)粘連現(xiàn)象。

2.2干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)差異CD133是相對(duì)分子質(zhì)量為1.20×105的跨膜糖蛋白分子，其表達(dá)的特點(diǎn)是隨著細(xì)胞的分化迅速下調(diào)，這使得它成為一個(gè)鑒定和分離干細(xì)胞的特異分子標(biāo)志。因此我們?cè)谂袛嗉?xì)胞球的干性時(shí)，將CD133強(qiáng)表達(dá)的細(xì)胞球判定為腫瘤干細(xì)胞球，而CD133弱表達(dá)的細(xì)胞球已經(jīng)發(fā)生分化，判定為普通腫瘤細(xì)胞球。經(jīng)計(jì)數(shù)顯示，無(wú)血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)法培養(yǎng)的第三代細(xì)胞球CD133陽(yáng)性率為92%，瓊脂上含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)法培養(yǎng)的第三代細(xì)胞球CD133陽(yáng)性率為65%，差異有顯著性。提示在富集黑色素瘤細(xì)胞系B16/F10中的腫瘤干細(xì)胞過(guò)程中，無(wú)血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)法的效率要明顯高于瓊脂上完全培養(yǎng)基培養(yǎng)法(圖2)。

①A①B①C②A②B圖1 細(xì)胞球形態(tài)差異:A.無(wú)血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)法第三代細(xì)胞球;B.瓊脂上含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)法第一代細(xì)胞球間存在黏附現(xiàn)象;C.瓊脂上含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)法第三代細(xì)胞球 圖2 細(xì)胞球CD133表達(dá)差異,SP法:A.腫瘤干細(xì)胞球中CD133呈強(qiáng)陽(yáng)性;B.普通腫瘤細(xì)胞球中CD133呈弱陽(yáng)性

3 討論

本組從培養(yǎng)過(guò)程、細(xì)胞球形態(tài)、成球的速度等方面比較結(jié)果顯示：無(wú)血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)法能快速穩(wěn)定有效地培養(yǎng)出形態(tài)規(guī)則、結(jié)構(gòu)緊密的細(xì)胞球，而瓊脂上含10%胎牛血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)法效率較慢，細(xì)胞球形態(tài)變化大，可能是由于血清的存在影響細(xì)胞成球過(guò)程。

免疫組化結(jié)果顯示，無(wú)血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的第三代細(xì)胞球CD133陽(yáng)性率為92%，瓊脂上完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的第三代細(xì)胞球CD133陽(yáng)性率為65%。無(wú)血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)法與瓊脂上含10%胎牛血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)法在黑色素瘤細(xì)胞系B16/F10干細(xì)胞的富集過(guò)程中差異比較有顯著性。無(wú)血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)法能穩(wěn)定快速有效的篩選出腫瘤干細(xì)胞，而瓊脂上含10%胎牛血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)法培養(yǎng)的細(xì)胞球中較大比例細(xì)胞球是不具干性的細(xì)胞球，對(duì)腫瘤干細(xì)胞的富集效果差、效率低。

無(wú)血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)法是目前常用的干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)法能富集腫瘤干細(xì)胞有以下原因：在低黏附性容器及無(wú)血清的條件下可以維持細(xì)胞未分化的狀態(tài)[3]，非腫瘤干細(xì)胞之間缺乏周圍細(xì)胞旁分泌及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的支持，極易發(fā)生凋亡[4]，而培養(yǎng)液中加入大劑量的生長(zhǎng)因子則可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，因此干細(xì)胞增殖，而非腫瘤干細(xì)胞增殖受到抑制，從而達(dá)到富集干細(xì)胞的目的。趙笛等[3]對(duì)無(wú)血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)法提出疑問(wèn)，培養(yǎng)環(huán)境是人為制造的選擇性培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞的環(huán)境：懸浮培養(yǎng)、無(wú)血清、高濃度的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，這些方面和體內(nèi)微環(huán)境差異較大，以及部分分化的細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)獲得干細(xì)胞潛能，因此得到的干細(xì)胞不一定等同體內(nèi)真正的干細(xì)胞，胡楊麗等[5]也有相似的觀點(diǎn)。 趙笛等[3]還提到培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞球的融合現(xiàn)象無(wú)法避免，會(huì)影響細(xì)胞球的克隆性。然而通過(guò)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)每個(gè)細(xì)胞球中細(xì)胞CD133表達(dá)強(qiáng)度是一致的，細(xì)胞球之間的融合是否存在特定的信號(hào)傳導(dǎo)，有待進(jìn)一步分析。

瓊脂上含10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法中細(xì)胞雖然處于懸浮狀態(tài)，缺乏周圍細(xì)胞旁分泌及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的支持，但由于血清的存在，細(xì)胞還是會(huì)分化，因此腫瘤干細(xì)胞的富集受到影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)此方法富集腫瘤干細(xì)胞的效率明顯地低于無(wú)血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)法。然而，與無(wú)血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)法相比，瓊脂含10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法培養(yǎng)環(huán)境能在一定程度上更接近體內(nèi)微環(huán)境，這種培養(yǎng)方法培養(yǎng)的腫瘤干細(xì)胞是否更接近體內(nèi)真正的干細(xì)胞？軟瓊脂上全血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法在腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)方面是否還有改進(jìn)的空間，這些有待進(jìn)一步研究。

體內(nèi)微環(huán)境復(fù)雜，隨時(shí)都在變化，該環(huán)境無(wú)法完全模擬。腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)過(guò)程中，研究者只能讓培養(yǎng)環(huán)境最大程度的接近體內(nèi)環(huán)境，所以需要不斷地探索和實(shí)驗(yàn)，使研究能更加接近事實(shí)真相，這值得科研人員進(jìn)一步探索。

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