劉月平，劉俊英，郭瑞霞， 丁 妍，賀宇彤，單保恩

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是由腫瘤細胞或間質(zhì)細胞分泌的、活化后可以降解細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的鋅離子依賴內(nèi)肽酶家族，MMP-9和MMP-13屬于MMPs家族，在MMPs激活過程中起重要作用；主要參與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移[1-3]。缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)屬于氧依賴的轉(zhuǎn)錄激活因子，在缺氧條件下HIF-1α的轉(zhuǎn)錄水平升高，參與腫瘤的生長及侵襲過程[4]。肺腺癌的靶向治療目前已取得突破性進展，但仍有部分患者不能采用靶向治療，對于這部分患者我們需要探索新的方法。本文應用免疫組化SP法染色檢測MMP-9、MMP-13、HIF-1α的表達，采用實時熒光PCR法檢測患者EGFR突變情況，探討肺腺癌中MMP-9、MMP-13、HIF-1α的表達與臨床病理特征、EGFR突變及預后的相關(guān)性，以期為肺腺癌患者的個體治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1臨床資料選取河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院病理科2011年3月～2015年3月所有行EGFR基因檢測的肺腺癌手術(shù)患者存檔資料629例，另選取原切口下癌旁正常組織及肺炎性假瘤樣增生組織各50例作為對照。629例肺腺癌患者中男性317例，女性312例；年齡20～80歲，平均59歲。所有標本均為手術(shù)標本，術(shù)前未進行放、化療?；颊呔研蠩GFR 18～21外顯子基因檢測；切片均經(jīng)兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師復診，按WHO(2015)肺腺癌分型標準分類，伏壁狀腺癌54例、腺泡狀腺癌372例、乳頭狀腺癌76例、實性腺癌93例、黏液腺癌23例、微乳頭狀腺癌11例。

1.2方法10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，每個蠟塊行4 μm厚連續(xù)切片4張，分別用于常規(guī)HE染色及免疫組化染色。免疫組化染色采用SP法，蠟塊行4 μm厚切片后，置于60 ℃烤箱干燥，貼附120 min。免疫組化采用羅氏Benchmark XT全自動免疫組化儀。MMP-9(濃縮液)及MMP-13(濃縮液)一抗稀釋濃度為1 ∶100，HIF-1α(濃縮液)一抗稀釋濃度為1 ∶50，抗原修復采用檸檬酸緩沖液高溫高壓熱修復。陽性對照采用已知的陽性切片，以PBS代替一抗做陰性對照，鼠抗人MMP-9單克隆抗體購自福州邁新公司，兔抗人MMP-13多克隆抗體、鼠抗人HIF-1α單克隆抗體均購自Abcam公司，DAB顯色試劑盒購自福州邁新公司。

EGFR基因檢測采用實時熒光PCR法檢測EGFR 18～21外顯子基因突變情況，采用羅氏Cobas DNA樣品制備及EGFR突變檢測試劑盒，具體操作步驟按試劑盒說明書進行，并采用羅氏Cobas Z480進行PCR分析，直接輸出結(jié)果。

1.3結(jié)果判定MMP-9和MMP-13均以胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色顆粒為陽性；HIF-1α陽性染色主要位于細胞質(zhì)或細胞核。由兩名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師分別進行獨立閱片，對結(jié)果進行評定。按染色強度計分：無陽性著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。400倍光鏡下隨機選擇5個高倍視野，每視野計數(shù)100個癌細胞，按陽性細胞的百分率計分：無陽性細胞為0分，陽性細胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，≥75%為4分。將兩項結(jié)果相乘：<4分為陰性，≥4分為陽性。

1.4隨訪通過電話隨訪，截止日期為2016年4月，隨訪的終點為隨訪截止日期或患者的死亡日期。電話隨訪的主要內(nèi)容包括患者目前的身體狀況、治療情況等。若無法聯(lián)系到該患者或其家屬，則視為失訪。本組隨訪600例，29例失訪，失訪率為4.6%。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學處理。多組率的比較用χ2檢驗，多組之間兩兩比較采用P值修正法，生存曲線采用Kaplan-Meier法，生存率的比較采用Log-rank法，用COX風險比例回歸模型進行單因素和多因素生存分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1MMP-9、MMP-13、HIF-1α在肺腺癌組和對照組中的表達629例肺腺癌組中MMP-9、MMP-13、HIF-1α陽性率分別為67.57%、74.88%、60.25%，均明顯高于癌旁正常組(22.00%、16.00%、18.00%)及肺炎性假瘤樣增生組(46.00%、42.00%、38.00%)，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.001，表1，圖1～3)。經(jīng)兩兩比較，肺腺癌與癌旁組織、肺腺癌與炎性假瘤樣增生組織、癌旁組織與炎性假瘤樣增生組織中MMP-9、MMP-13的表達差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.017)。HIF-1α在肺腺癌與癌旁組織、肺腺癌與炎性假瘤樣增生組織中差異有統(tǒng)計學意義(P<0.017)；在癌旁組織與炎性假瘤樣增生組織中表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.017)。

①②③

圖1MMP-9在肺腺癌中的表達，SP法圖2MMP-13在肺腺癌中的表達，SP法圖3HIF-1α在肺腺癌中的表達，SP法

表1 MMP-9、MMP-13、HIF-1α在肺腺癌和對照組中的表達

*P<0.05

2.2MMP-9、MMP-13、HIF-1α表達與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系MMP-9在肺腺癌組織中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(72.77%)陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(64.90%)；腫瘤直徑>3 cm者(73.37%)高于腫瘤直徑≤3 cm者(64.88%)，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。MMP-9與患者性別、年齡、吸煙史、腫瘤分期、病理分型、EGFR突變及是否胸膜受侵無關(guān)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

MMP-13在肺腺癌Ⅰ～Ⅲa期患者中的陽性率分別為68.56%、83.88%、83.33%；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(82.16%)陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(71.15%)；腫瘤直徑>3 cm者(79.90%)高于腫瘤直徑≤3 cm者(72.56%)；有吸煙史者(79.73%)高于無吸煙史者(72.13%)；差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。MMP-13與患者性別、年齡、病理分型、EGFR突變及胸膜受侵均無關(guān)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

HIF-1α在肺腺癌組織中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(65.73%)陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(57.45%)；有吸煙史者(65.64%)高于無吸煙史者(57.21%)；差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。HIF-1α的表達與患者性別、年齡、腫瘤分期、分型、腫瘤大小、EGFR突變及胸膜受侵無關(guān)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表2)。

2.3生存分析本組629例肺腺癌患者中，生存時間0.4～59.9個月，中位生存時間42.4個月。MMP-9陽性組和陰性組12、24、36個月的累積生存率分別為92.8%、78.6%、53.2%和98.5%、91.3%、89.9%，Log-rank法比較兩組生存率差異有顯著統(tǒng)計學意義(χ2=24.312，P<0.001，圖4)。MMP-13陽性組和陰性組12、24、36個月的累積生存率分別為93.1%、79.3%、60.3%和99.4%、93.6%、88.0%，Log-rank法比較兩組生存率差異有顯著統(tǒng)計學意義(χ2=14.832，P<0.001，圖5)。HIF-1α陽性組和陰性組12、24、36個月的累積生存率分別為94.1%、79.3%、58.4%和95.5%、88.6%、79.7%，Log-rank法比較兩組生存率差異有顯著統(tǒng)計學意義(χ2=9.706，P<0.05，圖6)。EGFR突變組和無突變組12、24、36個月的累積生存率分別為97.5%、96.6%、96.3%和95.6%、94.4%、92.9%，Log-rank法比較兩組生存率差異有顯著統(tǒng)計學意義(χ2=15.634，P<0.001，圖7)。

表2 MMP-9、MMP-13、HIF-1α表達與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系

*P<0.05

圖4 MMP-9陽性與陰性組生存曲線

圖5 MMP-13陽性與陰性組生存曲線

圖6 HIF-1α陽性與陰性組生存曲線

圖7 EGFR突變組與無突變組生存曲線

2.4COX回歸模型對各種可能影響生存的預后因素進行單因素分析，結(jié)果顯示：患者男性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤較大、胸膜受侵、有吸煙史、腫瘤分期晚、EGFR突變、MMP-9陽性、MMP-13陽性、HIF-1α 陽性均為肺腺癌患者生存的影響因素，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。將單因素分析有意義的變量納入COX多因素回歸模型，結(jié)果顯示：腫瘤較大、腫瘤分期晚、EGFR突變、MMP-9陽性、MMP-13陽性、HIF-1α陽性均為肺腺癌患者生存狀況的獨立危險因素，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。

表3 肺腺癌患者術(shù)后生存的單因素及多因素分析

3 討論

MMPs在胚胎發(fā)育、分化、腫瘤血管發(fā)生、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用[5]。MMP-9是MMPs中明膠酶的一種，能夠降解ECM中的Ⅳ型膠原[6]，從而參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。MMP-13基因位于MMPs級聯(lián)反應的中心位置，其能激活MMP-9、MMP-2等多種MMPs，也能被MMP-2、MMP-3和MT-MMP等活化，在腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移過程中具有重要意義。惡性腫瘤在生長過程中，由于組織增生過快會造成局部組織的嚴重缺氧，腫瘤細胞的缺氧適應主要由缺氧誘導因子介導，HIF-1α是HIF的主要氧調(diào)節(jié)亞基，可引起基質(zhì)MMPs的表達增加，進而促進惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移。

徐曉艷等[1]報道MMP-9與MMP-13在非小細胞肺癌中的表達呈正相關(guān)，但兩者表達與肺癌患者腫瘤大小及吸煙情況均無關(guān)。Kuo等[11]認為，HIF-1α的表達與患者吸煙史有相關(guān)性。本實驗結(jié)果顯示，MMP-13、HIF-1α與肺腺癌患者吸煙史有關(guān)，有吸煙史者陽性率高(P<0.05)，但MMP-9與肺腺癌患者吸煙史無關(guān)(P>0.05)；MMP-9、MMP-13均與腫瘤大小有關(guān)，腫瘤大者陽性率高(P<0.05)；MMP-13與患者腫瘤分期有關(guān)(P<0.05)；三者均在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性率高(P<0.05)。在肺癌患者吸煙史上多項研究結(jié)果不同，有待增加樣本進一步分析。本實驗結(jié)果提示腫瘤惡性程度越高，生長越快，直徑較大腫瘤內(nèi)部不能得到足夠的血液供應，局部組織、細胞缺氧顯著，促進HIF-1α過表達。同時HIF-1α上調(diào)其下游靶基因MMP-9的表達，從而降解腫瘤周圍基膜與ECM，為腫瘤侵襲創(chuàng)造條件，以適應腫瘤的生長需要。

肺癌尤其是肺腺癌的個體化靶向治療是當今研究的熱點，個體化靶向治療方案的制定關(guān)鍵在于鑒別、篩選出能明確預測患者可獲益于某種靶向治療的分子標志物[12]。目前，肺腺癌患者最突出的靶向治療方案為基于EGFR基因檢測基礎(chǔ)上的EGFR-TKI治療。Mulloy等[13]提出：EGFR基因突變導致EGFR有更強的激酶活性和催化效率，使胞外的活化信號更加強烈和持久的向胞內(nèi)表達，導致腫瘤細胞持續(xù)異常增殖。本實驗結(jié)果表明MMP-9、MMP-13和HIF-1α的表達均與患者EGFR突變情況無關(guān)(P>0.05)，故有待進一步擴大樣本、改進方法進行深入分析。

Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，MMP-9、MMP-13和HIF-1α陽性組12、24、36個月的累積生存率均明顯低于陰性組(P<0.05)。經(jīng)COX回歸模型單因素分析，結(jié)果顯示患者性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、胸膜受侵、吸煙史、腫瘤TNM分期、EGFR突變、MMP-9、MMP-13、HIF-1α的表達均為肺腺癌患者生存的影響因素(P<0.05)。將單因素分析有意義的變量納入COX多因素回歸模型，結(jié)果顯示：EGFR突變、MMP-9陽性、MMP-13陽性、HIF-1α 陽性均為肺腺癌患者生存狀況的獨立危險因素(P<0.05)。因此，MMP-9、MMP-13和HIF-1α在肺腺癌中的陽性及EGFR基因突變對患者預后評估有重要意義。

綜上所述，MMP-9、MMP-13和HIF-1α在肺腺癌組織中均存在過表達，且三者在肺腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移和預后中均發(fā)揮重要作用，三者的表達與肺腺癌EGFR突變情況無關(guān)，但均是肺腺癌患者生存狀況的獨立危險因素，因此三者存在獨立或聯(lián)合EGFR突變情況作為肺腺癌患者評估預后及制定治療方案的可能性。

[1] 徐曉艷，裴陸田，李秀霞. 非小細胞肺癌中MMP-9和MMP-13的表達及意義[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2014,30(12):1358-1363.

[2] Herszényi L, Hritz I, Lakatos G,etal. The behavior of matrix metalloproteinases and their inhibitors in colorectal cancer[J]. Int J Mol Sci, 2012,13(10):13240-13263.

[3] 廖渝蓉，胡興勝，鄒心怡，等. MMP-13在肺鱗癌和肺腺癌組織中的表達及預后價值[J]. 腫瘤防治研究, 2013,40(3):257-260.

[4] Park S, Ha S Y, Cho H Y,etal. Prognostic implications of hypoxia-inducible factor-1α in epidermal growth factor receptor-negative non-small cell lung cancer[J]. Lung Cancer, 2011,72(1):100-107.

[5] Sun H Z. Clinicopathological significance of stromal variables angiogenesis, lymphangiogenesis, inflammatory infiltration, MMP and PINCH in colorectal carcinomas[J]. Mol Cancer, 2006,5(43):1-20.

[6] Qiao Z K, Li Y L, Lu H T,etal. Expression of tissue levels of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in renal cell carcinoma[J]. World J Surg Oncol, 2013,11:1.

[7] Herszényi L, Hritz I, Lakatos G,etal. The behavior of matrix metalloproteinases and their inhibitors in colorectal cancer[J]. Int J Mol Sci, 2012,13(10):13240-13263.

[9] Choi J Y, Jang Y S, Min S Y,etal. Overexpression of MMP-9 and HIF-1α in breast cancer cells under hypoxic conditions[J]. J Breast Cancer, 2011,14(2):88-95.

[10] 何 斐,祁 琪,李 旭,等. 室內(nèi)空氣污染、HIF-1α基因單核苷酸多態(tài)性與福建漢族肺癌易感性的關(guān)系[J]. 中國肺癌雜志, 2017,20(3):149-156.

[11] Kuo W H, Shih C M, Lin C W,etal. Association of hypoxia inducible factor-1α polymorphisms with susceptibility to non-small-cell lung cancer[J]. Transl Res, 2012,159(1):42-50.

[12] Bunnell C A, Shulman L N. Will we be able to care for cancer patients in the future? [J]. Oncology (Williston Park), 2010,14:1343-1348.

[13] Mulloy R, Ferrand A, Kim Y,etal. Epidermal growth factor receptor mutants from human lung cancers exhibit enhanced catalytic activity and increased sensitivity to gefitinib[J]. Cancer Res, 2007,67:2325-2330.