馮玉梅，李思穎

(1.江蘇省連云港市贛榆區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 222100；2.江蘇省連云港市贛榆區(qū)中醫(yī)院檢驗(yàn)科 222100)

近年來，胃癌的發(fā)病率及病死率不斷攀升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，胃癌的病死率已升至惡性腫瘤病死率第1位，是第4種常見癌癥類型[1-2]。胃癌并不是不可醫(yī)治的，早期胃癌的5年生存率在90%以上，而晚期胃癌的5年生存率僅有20%左右[3]，可見對于胃癌的早期確診可以使患者早日接受治療，大大提高患者的生存率[4]。有研究表明，胃癌患者組織細(xì)胞中某些微小RNA(miRNA)的表達(dá)發(fā)生了較為明顯的變化[5-6]，因此有學(xué)者指出可將miRNA的表達(dá)變化作為胃癌診斷的標(biāo)志物[7]。本研究選取于連云港市贛榆區(qū)人民醫(yī)院接受治療的胃癌患者，對患者的血清和健康人血清標(biāo)本中的 miRNA-101(miR-101)與miRNA-25(miR-25)表達(dá)水平進(jìn)行檢測及比較，旨在為血清miR-101與miR-25在胃癌手術(shù)患者中的檢測價(jià)值研究提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年1月至2016年12月于連云港市贛榆區(qū)人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的82例胃癌患者為研究對象，其中男51例，女31例；年齡34～76歲，平均(57.6±7.8)歲。另選40例健康人作為對照組，其中男18例，女22例；年齡35～77歲，平均(58.1±7.4)歲。兩組研究對象年齡及性別上的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有患者均符合以下標(biāo)準(zhǔn)：(1)無其他惡性腫瘤；(2)經(jīng)診斷符合胃癌病理“金標(biāo)準(zhǔn)”；(3)接受過化療；(4)無溝通障礙；(5)患者及家屬知情并簽署研究知情同意書。

1.2主要儀器及試劑 (1)儀器：恒溫振蕩器(THZ-C，北京瑞邦興業(yè))，CO2培養(yǎng)箱(SCO2W-2，美國SHELLAB)，離心機(jī)(TGL-20M，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，紫外分光光度計(jì)(SpectroArt 200，美國 WEALTEC)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(ViiA7,美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，漩渦混合器(QL-902，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)。(2)試劑：Trizol試劑(杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司)，氯仿(北京鑫鼎鵬飛科技發(fā)展有限公司)，異丙醇(廣州市麒旭化工有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(杭州主諾生物科技有限公司)，100%乙醇(上海化學(xué)試劑有限公司)，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(寶生物工程有限公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本收集及保存 經(jīng)患者及家屬同意，胃癌組患者在手術(shù)3 d前及手術(shù)3 d后抽取靜脈血，靜置沉淀后經(jīng)離心10 min，取上清液并冷存于-80 ℃的液氮中進(jìn)行待檢。另外抽取對照組研究對象的靜脈血標(biāo)本靜置離心并保存，作為對比。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-101及miR-25表達(dá)水平 (1)提取總RNA：將冷凍柜中的血清標(biāo)本取出，加入Trizol試劑進(jìn)行反復(fù)顛倒直至混合均勻；將裂解液加入到EP管中，靜置后加入氯仿并進(jìn)行震蕩、靜置，之后置入離心器中離心15 min；去上層水后將離心液加入到新EP管中，加入異丙醇試劑并進(jìn)行靜置，離心10 min；去除上清液后加入乙醇洗滌、離心5 min后再次去除上清液；將沉淀中的RNA在室溫下自然干燥后用Rnase-free水進(jìn)行溶解，將RNA溶液置于-80 ℃冷凍柜中保存。(2)RNA水平及純度檢測：去RNA溶液樣品1 μL，加入去酶水進(jìn)行稀釋后，讀取紫外分光計(jì)在260 nm及280 nm處的吸光值，并根據(jù)讀值計(jì)算RNA的水平及純度(RNA水平=A260×40×稀釋倍數(shù))。(3)PCR反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：將6 μL RNA、4 μL 的qRT Super Mix、1 μL的1 mol/L RT stem loop primer、9 μL的Rnase-free水混合制備20 mL的反應(yīng)體系，在16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 4 min的反應(yīng)條件下進(jìn)行反應(yīng)；在95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次的條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將合成的cDNA作為模板，并加入premix、探針進(jìn)行反應(yīng)；采集熒光并將U6sRNA作為內(nèi)參檢測miR-101及miR-25的表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件對研究中得到數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有變量采用正態(tài)性檢驗(yàn)，表達(dá)水平進(jìn)行2-ΔΔCt計(jì)算并進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換。將結(jié)果進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)，兩組計(jì)量結(jié)果比較采用t檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1miR-101及miR-25純度及水平 經(jīng)檢測結(jié)果顯示，患者標(biāo)本中RNA的A260/A280均大于1.8而小于2.0，水平均大于20 μg/mL而小于50 μg/mL，符合進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。

2.2兩組研究對象血清miR-101的相對表達(dá)水平 PCR擴(kuò)增反應(yīng)后回收條帶，回收條帶如圖1。胃癌組患者術(shù)前miR-101的相對表達(dá)水平為0.732±0.147，術(shù)后為1.543±0.262，均明顯低于對照組miR-101的相對表達(dá)水平(2.394±0.476)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；胃癌組患者術(shù)后miR-101的相對表達(dá)水平高于術(shù)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 PCR反應(yīng)回收條帶

2.3兩組研究對象血清miR-25的相對表達(dá)水平 胃癌組患者術(shù)前miR-25的相對表達(dá)水平為2.648±0.139，術(shù)后為1.271±0.270；對照組miR-25的相對表達(dá)水平為-0.087±0.019；胃癌組患者血清術(shù)前、術(shù)后的miR-25的相對表達(dá)水平均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；患者術(shù)后miR-25的相對表達(dá)水平低于術(shù)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

胃癌作為一種惡性腫瘤，在早期發(fā)現(xiàn)并且進(jìn)行診治可以大大提高患者的存活率，但是由于胃癌在早期的癥狀表現(xiàn)通常不夠明顯，在胃癌早期進(jìn)行確診具有一定的難度，因此胃癌的病死率居高不下，成為威脅人們身體健康以及生命安全的一大危險(xiǎn)因素。miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的通過控制靶蛋白來控制細(xì)胞的生理過程的一種非編碼單鏈小分子RNA[8]。有研究表明，miRNA具有影響腫瘤細(xì)胞發(fā)展進(jìn)程的作用，在腫瘤發(fā)展過程中，不同miRNA的表達(dá)水平發(fā)生了不同的變化[9]。因此，有研究指出，miRNA對于腫瘤的發(fā)展進(jìn)程的判斷具有重要價(jià)值[10]，但是也有學(xué)者表示，血清miRNA表達(dá)譜與腫瘤細(xì)胞中miRNA表達(dá)譜并不一致[11]。為探討胃癌患者血清中miR-101與miR-25診斷價(jià)值，本研究比較了胃癌患者與健康人體血清中miR-101與miR-25表達(dá)水平的差異，也比較了對于同一胃癌患者術(shù)前術(shù)后miR-101與miR-25的變化水平，旨在為miR-101與miR-25在胃癌中的診斷提供思路。

有研究表明，在肺癌、乳腺癌、前列腺癌等腫瘤疾病中，miR-101可以通過抑制多種靶基因的表達(dá)來抑制多種腫瘤細(xì)胞的增長[12]；同時(shí)miR-101的表達(dá)可以抑制癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，而細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化可以減少細(xì)胞間的黏附蛋白，使癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散加速[13]。因此miR-101的表達(dá)可以抑制癌細(xì)胞的增長、轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散，而miR-101的低表達(dá)會使抑制作用減弱，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。本研究中胃癌組患者術(shù)前及術(shù)后血清miR-101的相對表達(dá)水平均明顯低于對照組(P<0.05)；患者手術(shù)后miR-101的表達(dá)水平明顯高于術(shù)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，驗(yàn)證了之前研究中對于miR-101診斷價(jià)值的推斷。

miR-25在腫瘤疾病中的研究較多，據(jù)研究顯示，miR-25在多種腫瘤發(fā)生時(shí)表達(dá)水平發(fā)生了上升，而在結(jié)直腸癌等其他腫瘤發(fā)展進(jìn)程中表達(dá)水平上調(diào)，因此在胃癌中miR-25表達(dá)水平動態(tài)變化存在一定爭議。本研究中胃癌患者術(shù)前、術(shù)后血清miR-25的相對表達(dá)水平均明顯高于對照組，患者手術(shù)后miR-25的表達(dá)水平明顯低于術(shù)前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，與健康人相比，胃癌患者血清中miR-101的相對表達(dá)水平下降，而miR-25的相對表達(dá)水平上升；胃癌患者手術(shù)后miR-101的表達(dá)水平明顯上升，而miR-25的表達(dá)明顯降低。因此說明miR-101與miR-25的表達(dá)水平可以作為胃癌診斷的標(biāo)志物。

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