楊旭潔，盧永杰，陳 捷，吳曉娟，蘇真珍，蔡 蓓

(四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，成都 610041)

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO) 統(tǒng)計(jì)，全世界大約有20億以上的人感染了乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)，其中約有3.6億為慢性乙肝，10%～20%可發(fā)展為肝硬化，1%～5%可發(fā)展為肝癌[1]。肝臟是人體的代謝器官，一些與藥物代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的物質(zhì)，比如細(xì)胞色素氧化酶P450(CYP450)和P-糖蛋白(P-gp)如果出現(xiàn)異常，將影響外源性和內(nèi)源性有害物質(zhì)的代謝，進(jìn)而可能影響疾病的發(fā)展。CYP450主要有CYP1、CYP2、CYP3家族，其中CYP3A5是CYP家族中活性最強(qiáng)的酶之一[2]。P-gp由多藥耐藥基因(MDR1)編碼，其生理作用是保護(hù)細(xì)胞免受毒物及代謝產(chǎn)物損害[3]。宿主遺傳背景不同，這些與藥物代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的物質(zhì)也會(huì)有差異，這可能會(huì)導(dǎo)致宿主的疾病進(jìn)展不同。本文探討宿主遺傳背景即CYP3A5和MDR1基因型與乙肝患者病程進(jìn)展的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2016年1-11月就診的HBV感染患者共524例，其中慢性乙肝187例(慢性乙肝組)，乙肝性肝硬化163例(乙肝肝硬化組)，乙肝性肝癌174例(乙肝肝癌組)。診斷根據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南》2015年制訂的標(biāo)準(zhǔn)、《乙肝相關(guān)肝硬化診療規(guī)范專家共識(shí)2014》及《美國(guó)肝病研究學(xué)會(huì)指南》在乙肝相關(guān)肝癌診斷中的驗(yàn)證及診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。慢性乙肝組男女比例17∶9，年齡24～63歲、中位年齡43歲；乙肝肝硬化組男女比例17∶10，年齡37～70歲、中位年齡52歲；乙肝肝癌組男女比例27∶8，年齡27～68歲、中位年齡48歲。納入的研究對(duì)象在年齡、性別比方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。臨床資料及標(biāo)本的獲取經(jīng)華西倫理委員會(huì)審議通過(guò)。

1.2方法

1.2.1DNA提取 采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司提供的全血基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)提取標(biāo)本DNA。收集上述患者外周血標(biāo)本，取200 μL放入1.5 mL離心管；加入20 μL蛋白酶K(20 mg/mL)溶液，室溫放置15 min(期間顛倒混勻幾次)；加入200 μL 結(jié)合液CB，立刻劇烈顛倒輕搖，充分混勻，70 ℃放置10 min；加入100 μL異丙醇(陳舊血加200 μL異丙醇)，劇烈顛倒輕搖，充分混勻；將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱Ⅵ中(吸附柱放入收集管中),10 000 r/min離心30 s，棄廢液；加入500 μL抑制物去除液IR，12 000 r/min 離心30 s，棄廢液；加入500 μL漂洗液WB(已加入無(wú)水乙醇的WB)，12 000 r/min離心30 s，棄廢液；加入500 μL漂洗液WB，12 000 r/min離心30 s，棄掉廢液；將吸附柱Ⅵ放回空收集管中，13 000 r/min離心2 min。取出吸附柱Ⅵ，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100 μL洗脫緩沖液EB(洗脫緩沖液事先在 65～70 ℃水浴中預(yù)熱)，室溫放置3～5 min，12 000 r/min離心1 min；將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2 min，12 000 r/min離心1 min；DNA分裝并放置在-80 ℃。

1.2.2聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)反應(yīng)和基因型檢測(cè) 采用羅氏MIX試劑和Lightcycler480進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物的基因型檢測(cè)。引物序列如下，CYP3A5(6986A>G) 正向：ACC ACC CAG CTT AAC GAA TG，CYP3A5(6986A>G)反向：TTG TAC GAC ACA CAG CAA CCT；MDR-1(3435C>T)正向：GCT GAG AAC ATT GCC TAT GGA，MDR-1(3435C>T)反向：GCA TGT ATG TTG GCC TCC TT。反應(yīng)體系組成：1 μL DNA標(biāo)本，0.5 μL正向引物，0.5 μL反向引物，1.4 μL熒光染料(EVA-GREEN)，0.5 μL底物，0.2 μL Taq酶，2 μL緩沖液，1 μL 50 mmol/L MgCl2。反應(yīng)條件及過(guò)程：先95 ℃孵育15 min，接著完成95 ℃×10 s，60 ℃×15 s，72 ℃×20 s，共計(jì)50個(gè)循環(huán)，接著95 ℃孵育1 min，40 ℃孵育1 min，65 ℃孵育1 s，最后以0.01 ℃/s加熱到95 ℃。

2 結(jié) 果

2.1各組肝功能及凝血指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 慢性乙肝組與乙肝肝硬化組的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、纖維蛋白原(FIB)、甲胎蛋白(AFP)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，總蛋白(TP)、清蛋白(ALB)、總膽紅素(TB)、直接膽紅素(DB)、HBV脫氧核糖核酸(HBV-DNA)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；慢性乙肝組與乙肝肝癌組的TB、ALT、PT、INR、APTT水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TP、ALB、DB、AST、ALP、GGT、FIB、AFP、HBV-DNA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；乙肝肝硬化組與乙肝肝癌組的AST、ALP、HBV-DNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，ALB、TB、DB、ALT、GGT、PT、INR、APTT、FIB、AFP水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組肝功能及凝血指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果[M(P25～P75)]

組別nASTALPGGTPTINR慢性乙肝組18735(27～64)84(62～108)33(13～64)13.9(12.4～19.4)1.27(1.11～1.74)乙肝肝硬化組16351(34～84)96(70～154)41(21～95)13.9(15.7～17.9)1.39(1.24～1.59)乙肝肝癌組17472(36～113)*105(83～163)*68(34～159)*#12.8(12.2～13.8)#1.14(1.08～1.23)#

組別nAPTTFIBAFPHBV-DNA慢性乙肝組18732.5(30.5～32.7)1.67(1.55～1.79)7.88(3.20～15.1)1.21E+5(2.92E+4～1.21E+6)乙肝肝硬化組16337.5(32.1～43.0)1.72(1.2～2.3)3.83(1.99～8.09)1.04E+3(1.00E+3～5.80E+4)*乙肝肝癌組17429.7(27.0～33.7)#3.09(2.42～3.92)*#64.60(4.67～738.35)*#1.01E+3(1.00E+3～9.9E+3)*

注：與慢性乙肝組比較，*P<0.05；與乙肝肝硬化組比較，#P<0.05

2.2各組間CYP3A5基因分布頻率 CYP3A5等位基因GG、AG、AA的分布頻率分別在慢性乙肝組和乙肝肝硬化組、慢性乙肝組和乙肝肝癌組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而乙肝肝硬化組和乙肝肝癌組的等位基因分布頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3各組間MDR1 C3435T基因分布頻率 MDR1 C3435T的等位基因CT、CC分布頻率在慢性乙肝組和乙肝肝硬化組、乙肝肝硬化組和乙肝肝癌組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在慢性乙肝組和乙肝肝癌組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表2 各組間CYP3A5基因分布頻率比較[n(%)]

注：與慢性乙肝組比較，△P<0.05

表3 各組間MDR1 C3435T基因分布頻率比較[n(%)]

注：與乙肝肝硬化組相比，*P<0.05

3 討 論

慢性乙肝在我國(guó)發(fā)病率較高,HBV感染后部分患者發(fā)展為慢性肝炎,并可發(fā)展成肝硬化和肝癌，進(jìn)程不一，藥物治療的反應(yīng)個(gè)體差異亦很大[5]。已知HBV感染后的疾病進(jìn)展與黃曲霉素、生活方式、環(huán)境和遺傳等因素有關(guān)[6]。一些與藥物代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的物質(zhì)(如CYP450和P-gp)如果出現(xiàn)異常，將影響外源性和內(nèi)源性有害物質(zhì)的代謝，進(jìn)而影響疾病的發(fā)展。環(huán)境因素特別是接觸黃曲霉素與肝癌的發(fā)生密切相關(guān),研究顯示，CYP3A5可代謝黃曲毒素B1成為致突變物黃曲毒素B1-外-8,9-環(huán)氧化物[7]，后者是肝細(xì)胞癌的主要危險(xiǎn)因子。

CYP450廣泛分布于人體各器官組織中，在肝臟中水平最豐富。編碼CYP3A的基因位于人類第7號(hào)染色體q21.3-22.1。人類共有18個(gè)CYP450基因家族和43個(gè)亞家族，涉及多數(shù)藥物代謝的酶系主要有CYP1、CYP2、CYP3家族。其中CYP3A 亞家族成員作用尤為突出，水平最多、底物譜大，是藥物代謝反應(yīng)中最主要的限速酶[8]。在CYP3A家族主要有4種基因亞型參與藥物代謝：CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7 及CYP3A43。其中CYP3A5是CYP4503 A家族中活性最強(qiáng)的酶之一。CYPs主要負(fù)責(zé)內(nèi)源性底物、外源性物質(zhì)和許多其他合成化學(xué)物質(zhì)的代謝[9]。

近年來(lái)，大量文獻(xiàn)報(bào)道CYP3A5基因多態(tài)性與腫瘤發(fā)生有相關(guān)性。CYP3A5催化許多前致癌物轉(zhuǎn)化成終致癌物，被認(rèn)為在各種癌癥易感性中起重要作用。前已述及，CYP3A5可代謝黃曲毒素成為一種致突變物，這種物質(zhì)是肝細(xì)胞癌的主要危險(xiǎn)因子，故CYP3A5的遺傳多態(tài)性可影響個(gè)體患肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)[10]。

本試驗(yàn)通過(guò)比較慢性乙肝組與乙肝肝硬化組以及乙肝肝癌組的CYP3A5基因分布頻率，發(fā)現(xiàn)慢性乙肝與乙肝肝硬化、乙肝肝癌組基因分布頻率不同，慢性乙肝組的A基因分布頻率明顯低于乙肝肝硬化組和乙肝肝癌組，而G基因頻率明顯高于乙肝肝硬化組和乙肝肝癌組。由于CYP3A5與黃曲霉菌代謝有關(guān)，同樣是感染HBV后，含有CYP3A5 G基因的人體內(nèi)的CYP3A5不能將黃曲霉菌轉(zhuǎn)化為代謝物形式，進(jìn)展為腫瘤的危險(xiǎn)性相對(duì)較小，所以突變型G成為保護(hù)性基因，而含A基因的個(gè)體進(jìn)展為肝硬化或肝癌的危險(xiǎn)性較高。

人類MDR1位于第7號(hào)染色體長(zhǎng)臂上,含有28個(gè)外顯子,全長(zhǎng)為4.5 kb,含有一個(gè)開(kāi)放讀框,編碼1 280個(gè)氨基酸多肽,經(jīng)糖基化后形成170×103的膜糖蛋白(P-gp)。研究報(bào)道MDR1 C3435T與MDR1基因的蛋白產(chǎn)物P-gp功能密切相關(guān)[11]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),MDR1 多態(tài)性不僅是影響腫瘤患者對(duì)化療藥物反應(yīng)的重要遺傳因素,也與患者對(duì)疾病的易感性及臨床表現(xiàn)有關(guān)[12]。MDR1 C3435T 基因多態(tài)性與白血病、結(jié)直腸癌、腎細(xì)胞癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、鼻咽癌、胃癌等惡性腫瘤易感性的相關(guān)性研究已有報(bào)道[13],在肝癌方面的研究尚少見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)通過(guò)比較慢性乙肝組與乙肝肝硬化組、乙肝肝癌組的MDR1 C3435T基因分布頻率，發(fā)現(xiàn)MDR1 C3435T的等位基因CT、CC分布頻率在慢性乙肝組和乙肝肝硬化組、乙肝肝硬化組和乙肝肝癌組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在慢性乙肝組和乙肝肝癌組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示藥物代謝相關(guān)的基因突變可能與HBV感染后進(jìn)展至肝癌的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，而藥物轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因突變雖然與疾病進(jìn)展有相關(guān)性，但本試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)MDR1 C3435T與肝癌風(fēng)險(xiǎn)有相關(guān)性，也不排除由于其他因素(比如性別、年齡等)導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確，所以尚需做進(jìn)一步研究。

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