□ 李學(xué)興 石 琳 梁 偉 云南省玉溪市食品藥品檢驗(yàn)所

TTC化學(xué)名為2.3.5-氯化三苯基四氮唑，別名氯化三苯四氮唑，在微生物檢驗(yàn)中起染色作用，其原理是TTC和活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，生成紅色的還原產(chǎn)物，使菌落變紅色，便于菌落計(jì)數(shù)。在微生物檢驗(yàn)工作中,菌落總數(shù)測定是用于檢驗(yàn)樣品被污染程度的一項(xiàng)基本指標(biāo)?，F(xiàn)行《中國藥典》[1]藥品微生物學(xué)檢測方法以胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)技術(shù)需氧菌總數(shù)（包括真菌菌落數(shù)）；食品檢驗(yàn)國家標(biāo)準(zhǔn)中食品微生物學(xué)檢驗(yàn)的菌落總數(shù)測定［2］采用平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)菌落總數(shù)；化妝品國家標(biāo)準(zhǔn)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）［3］中介紹：在每100 mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中可加入0.5%氯化三苯四氮唑(TTC)溶液1 mL用于菌落總數(shù)的測定的實(shí)驗(yàn)方法中。在實(shí)驗(yàn)過程中有時(shí)候因?yàn)楸粰z驗(yàn)樣品中含有沉渣（藥品藥渣、食品中的碎屑、化妝品中的顆粒等），其形態(tài)類似細(xì)菌或覆蓋菌落給菌落計(jì)數(shù)工作造成一定的困難。為了防止細(xì)菌的蔓延生長和便于計(jì)數(shù)，有時(shí)可以加入適量的TTC進(jìn)行染色從而方便菌落計(jì)數(shù)，提高菌落計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性?！端幤沸l(wèi)生檢驗(yàn)方法》（1990年版）［4］指出，一般是1%TTC加到培養(yǎng)基后的最終濃度為0．001%。但實(shí)際工作中，常常會(huì)碰到一些不正確的做法。目前，有些檢驗(yàn)人員在進(jìn)行微生物學(xué)檢測時(shí)，培養(yǎng)基中加入過量的TTC，這樣計(jì)數(shù)所得的菌落數(shù)結(jié)果，往往是偏少或不準(zhǔn)確。為了解含不同濃度TTC培養(yǎng)基對(duì)微生物菌落生長的抑制性，本文對(duì)6種菌株加入6個(gè)不同濃度的TTC培養(yǎng)基［5］及不加TTC培養(yǎng)基的菌落生長結(jié)果進(jìn)行了考察研究。

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器設(shè)備

HRLM-80型立式蒸汽滅菌器（青島海爾特種電器有限公司）、SPX-150生化培養(yǎng)箱（慧科電子有限公司）、BP1502型電子天平（梅特勒—托利多儀器有限公司）、BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)3104855）、0.5%無菌TTC溶液（批號(hào)6104032），均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2.1 培養(yǎng)基制備

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基按照使用說明用蒸餾水配制后采用濕熱滅菌處理恒溫待用，參考孔秀珍《在化妝品菌落測定中應(yīng)用TTC的探討》［6］，臨用前用帶無菌槍頭的移液槍將0.5%無菌TTC加入恒溫45 ℃的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基中分別制成每100 mL培養(yǎng)基中含TTC為 10.0、5.0、2.5、1.5、1.0、0.5 mg 6個(gè)不同濃度。

1.3 菌株及來源

大腸埃希菌[CMCC（B）44102〕第3代；乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50 094]第3代；枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]第3代；白色念珠菌[CMCC（F）98 001]第3代；黑曲霉[CMCC（F）98 003]第3代；金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]第3代。以上菌種均來自中國食品藥品檢定研究院，所用菌液在實(shí)驗(yàn)前取新鮮培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫為菌懸液并用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至最終濃度為每1 mL中含菌落數(shù)為50～100 CFU/mL。

2 試驗(yàn)方法

按無菌操作分別用無菌吸管取經(jīng)稀釋含菌落數(shù)為50～100 CFU/mL的大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉、金黃色葡萄球菌各1 mL注入無菌平皿，平行制備2個(gè)平皿（結(jié)果取平均值），然后分別傾注含各不同濃度TTC胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基15～20 mL，混勻，待凝固后35℃倒置培養(yǎng)72 h計(jì)數(shù)結(jié)果（培養(yǎng)期間逐日觀察計(jì)數(shù)），計(jì)數(shù)結(jié)果見表1。

3 結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過不同濃度的TTC胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基與不加TTC胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果對(duì)比，在6株供試驗(yàn)的菌株（6株菌株性質(zhì)分別為：2株革蘭氏陽性菌代表、2株革蘭氏陰性菌代表、1株真菌代表、1株霉菌代表，其中乙型副傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌為食品衛(wèi)生檢驗(yàn)項(xiàng)目的常規(guī)致病菌代表。）加入每100 mL培養(yǎng)基10.0、5.0、2.5、1.5、1.0、0.5 mg 6個(gè)不同濃度TTC胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)后，大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門氏菌、黑曲霉菌對(duì)各個(gè)濃度TTC均表現(xiàn)為不敏感；金黃色葡萄球菌在TTC濃度分別為5.0 mg和10.0 mg時(shí)表現(xiàn)為生長抑制、生長緩慢，且菌落小如針尖培養(yǎng)至72 h勉強(qiáng)可計(jì)數(shù)，金黃色葡萄球菌的其他TTC濃度在培養(yǎng)24 h時(shí)候菌落即生長旺盛便于計(jì)數(shù)；枯草芽孢桿菌、白色念珠菌在TTC濃度分別為5.0 mg時(shí)表現(xiàn)為有輕微抑制作用,10.0 mg時(shí)枯草芽孢桿菌表現(xiàn)為抑制但稍有菌落生長，白色念珠菌表現(xiàn)為完全抑制生長。本次試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中加高濃度TTC對(duì)此次實(shí)驗(yàn)菌株的革蘭氏陽性菌表現(xiàn)顯著抑制，對(duì)革蘭氏陰性菌表現(xiàn)無抑制，且TTC濃度越高,抑制作用越明顯。每100 mL培養(yǎng)基含TTC濃度在0.5 mg及以下時(shí)菌落不顯紅色，TTC已不能起染色作用，因此也失去了其使用價(jià)值。本次實(shí)驗(yàn)證明加入培養(yǎng)基TTC適宜濃度為1.0～2.5 mg/100 mL，不應(yīng)達(dá)5.0 mg/100 mL（化妝品安全技術(shù)規(guī)范菌落總數(shù)測定中每100 mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中加入0.5%TTC溶液1 mL達(dá)到5 mg/100 mL的濃度有待考究適宜性）及以上濃度，加入過高濃度的TTC培養(yǎng)基檢測微生物會(huì)使樣品中微生物菌落受到抑制，甚至一定濃度的TTC會(huì)導(dǎo)致某些菌落種類不生長的情況，從而影響樣品微生物計(jì)數(shù)結(jié)果的真實(shí)性和判斷實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

表1 不同濃度TTC培養(yǎng)基各菌落生長情況表

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].中國醫(yī)藥科技出版社 ,2015：81-85.

[2]國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì),國家食品藥品監(jiān)督管理總局.GB 4789.2-2016食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2017.

[3]國家食品藥品監(jiān)督管理總局.化妝品安全技術(shù)規(guī)范[Z].2015：471-474.

[4]中華人民共和國衛(wèi)生部.藥品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法[Z].1990：10-11.

[5][6]孔秀珍.程潔萍.在化妝品菌落總數(shù)測定中應(yīng)用TTC的探討[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2006(7)：831-832