□ 崔 晗 劉玥婷 沈葆真 劉夢遙 大連出入境檢驗檢疫局

隨著工業(yè)生產和社會的飛速發(fā)展，全球沿海地區(qū)大量的工業(yè)廢水和生活污水排入海洋，導致水體富營養(yǎng)化，海洋環(huán)境日趨惡化，赤潮頻繁發(fā)生，赤潮藻毒素泛濫，海洋貝類通過濾食在體內富集，再通過食物鏈傳遞到食用的人和動物身上，對健康產生危害[1]。由貝類毒素引起的人體中毒事件不斷發(fā)生，同時赤潮對海洋養(yǎng)殖業(yè)也造成破壞性損失。

1 脂溶性貝類毒素簡介

貝類毒素（shellfish toxin）又稱赤潮生物毒素（red tide toxin），是赤潮生物產生的一系列天然活性毒素。濾食性魚、蝦和貝類通過濾食活動將這些毒素富集在體內，導致海洋生物中毒，這些中毒的魚、蝦和貝類再通過食物鏈的傳遞導致食用的人和動物中毒。因為不同的赤潮生物產生不同的貝類毒素，造成貝類毒素化學結構和特性的巨大差異。2004年，由世界衛(wèi)生組織、聯(lián)合國糧農組織和政府間海洋委員會共同組建的雙殼軟體生物毒素工作組將貝類毒素分為8類，包括大田軟海綿酸毒素組（okadaic acid，OA）、蝦夷扇貝毒素組（yessotoxin，YTX）、原多甲酸毒素組（azaspiracid，AZA）、蛤毒素組（pecenotoxin，PTX）、短裸甲藻毒素組（brevetoxin，BTX）、環(huán)亞胺類毒素組（cyclic imine，CI）、軟骨藻酸組（domoic acid，DA）和石房蛤毒素組（saxitoxin，STX）。現(xiàn)有的8大類貝類毒素中DA和STX易溶于水，為水溶性貝類毒素（hydrophilic phycotoxins，HPs）， 而 OA、YTX、AZA、PTX、BTX和CI為聚醚類物質，易溶解于甲醇、乙醚等有機試劑，因此被稱作脂溶性貝類毒素（lipophilic phycotoxins，LPs）。LPs具有熱穩(wěn)定性，通過加熱等常規(guī)加工方式只能降低產品的水分含量，而不能導致LPs的降解，這類貝毒在貝類內臟和肉質等組織中的分布情況也不存在顯著性差異。目前，已發(fā)現(xiàn)的LPs引起的中毒癥狀多為腹瀉、惡心、嘔吐等，中毒癥狀較普通細菌感染發(fā)作時間短，通常為食用后幾小時，甚至短至幾十分鐘，且沒有相應的解毒藥物治療，所以這類毒素對消費者帶來的潛在危害更難預防，已成為當前貝類毒素研究的重要關注領域。

2 脂溶性貝類毒素檢測方法分析

目前，LPs的檢測方法主要有小鼠生物法、生物免疫法、細胞毒性法以及近年來迅速發(fā)展的化學儀器分析法等，小白鼠生物法在未知貝毒的發(fā)現(xiàn)和研究過程中發(fā)揮了巨大作用，目前仍是我國法定的分析方法，并在世界范圍內被普遍采用，但是該方法由于內在的不確定度超過20%以及動物福利等種種原因，歐盟、加拿大等地區(qū)與國家已相繼提出了化學儀器分析技術替代小鼠生物法的建議，繼而推動了液相色譜質譜聯(lián)用（LC- MSn）技術在LPs檢測領域的快速發(fā)展。

2.1 小鼠生物法

小鼠生物法是由Yasumoto 等建立的[2]，為全世界許多國家監(jiān)測LPs所使用，該法用丙酮從貝類組織中提取出毒素，再經減壓濃縮蒸干，用1%的吐溫60溶解殘留物，腹腔注射小白鼠，觀察其存活情況，根據小鼠不同的死亡時間，判斷毒性的大小。該方法的優(yōu)點是技術容易掌握，不需要使用大型分析儀器，但特異性較差，不能提供特定LPs的檢出限，在檢測過程中，多種LPs如 OA、YTX 、PTX和 AZA等毒素可能被同時檢測到，甚至包括毒性未知的其他貝類毒素，對小鼠都具有毒性作用。由于易受到游離脂肪酸等內源性化合物的影響，極易造成假陽性結果，且動物死亡時間的判斷受主觀因素以及小鼠個體特性的影響，導致該方法準確性不高。此外，小鼠活體毒性試驗越來越受到動物保護主義者的反對，目前，很多國家已逐步禁止該方法的使用。

2.2 生物免疫法

和小鼠生物法相比較，免疫分析法具有更好的特異性和靈敏度，該方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[3]和放射免疫法（RIA）。目前，已有酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒應用于LPs的測定，市售的DSP Check R 和Rougier Bio-Tech R兩種試劑盒均能從甲基-OA提取物中準確定量出OA含量，與化學儀器分析法相比，檢測更快速，但由于LPs的毒性與甲基-OA、OA或這兩種物質的混合物的含量都有關系，導致ELISA法不能夠準確地判斷貝類產品的總毒性。生物免疫法作為重點發(fā)展的貝毒檢測技術之一，也應用于生物傳感器上，未來幾年在現(xiàn)場和快速高效貝類毒素檢測方面，用來檢測LPs復合物毒素的生物傳感器可能會有很好的發(fā)展前景。生物免疫法與其他非化學性分析方法相比，在靈敏度、特異性上有了很大的提高，但必須有高質量的酶制劑，且無法提供詳細的毒素成分信息等，這也限制了該方法在貝類毒素定性和定量方面的應用。

2.3 細胞毒性法

細胞毒性法是LPs體外細胞測試法中較為常見的一種分析方法，主要是用血清培養(yǎng)鼠白血病細胞，再加入LPs毒素提取物，細胞生長受到抑制，通過測定細胞受抑制的情況來定量LPs。該方法選取的細胞在整個毒性測試過程中極易出現(xiàn)大面積死亡的情況，方法重現(xiàn)性無法滿足檢測需求，不適于推廣應用。

2.4 化學儀器分析法

LPs的化學儀器分析法主要指液相色譜法（LC）和液相色譜質譜聯(lián)用法（LC-MSn）[4]。LC法通過連接紫外或熒光等不同的檢測器來檢測不同的LPs毒素成分，但由于大部分LPs在紫外區(qū)無吸收或吸收較弱，且不具備自發(fā)熒光能力，只有極少數如OA毒素可通過9-蒽基疊氮甲烷衍生后，用熒光檢測器進行定量，因此LC法在檢測LPs的領域受到局限。目前，隨著液相色譜質譜聯(lián)用（LC-MSn）技術的不斷發(fā)展，國外已逐步將LC-MSn法用于LPs的分析，并對其特征和含量進行研究，2012年，歐盟提出將液相色譜-串聯(lián)質譜法（LC-MS/MS）作為貝毒測定的參考方法（EN 16204-2012），美國、加拿大及國際食品法典委員會也相繼提出用LC-MS/MS法替代小鼠生物法作為貝毒標準檢測方法的建議，同時大幅度降低了貝類毒素的限量標準。LCMS/MS法在LPs分析中具有明顯的優(yōu)越性：①靈敏度高；②特異性強；③分析時間短；④能夠準確定量不同毒素組分。雖然這種方法研究起步較晚，但發(fā)展極為迅速，目前所有LPs毒素組均建立了相應的LC-MS/MS分析方法，而且該方法的定性和未知物篩查能力，對于新型毒素的發(fā)現(xiàn)和確證有很廣闊的發(fā)展前景。

3 建議

我國已于2016年正式發(fā)布了GB 5009.212-2016《食品安全國家標準貝類中腹瀉性貝類毒素的測定》，規(guī)定了小鼠生物法、酶聯(lián)免疫吸附法和液相色譜-串聯(lián)質譜法三種方法均可作為腹瀉性貝類毒素大田軟海綿酸（OA）、鰭藻毒素-1（DTX-1）和鰭藻毒素-2（DTX-2）的標準檢測方法，建議今后以分析方法標準化為基礎，系統(tǒng)地開展我國LPs的污染狀況及分布規(guī)律研究、LPs毒理學和生態(tài)毒理學研究、貝類產品中LPs的限量標準和管控措施等，以提高我國貝類毒素研究能力和監(jiān)管水平。

[1]周名江,李鈞,于仁誠,等.赤潮藻毒素研究新進展[J].中國海洋藥物 ,1999：48-54.

[2]Yasumoto T, Oshima Y, Yamaguchi M. Occurrence of a New Type of Shellfish Poisoning in the Tohoku District[J].Nihonsuisan-gakkai-shi,1978(11)：1249-1255.

[3]Uzuki T, Yoshizawa R, Kawamura T,et al. Interference of Free Fatty Acids from the Hepatopancreas of Mussels with the Mouse Bioassay for Shellfish Toxins[J].Lipids,1996(6)：641-645.

[4]Jorge R, Araceli E R, Gonzalo L, et al. Automated Online Solid-phase Extraction Coupled to Liquid Chromatographytandem Mass Spectrometry for Determination of Lipophilic Marine Toxins in Shellfish[J].Food Chemistry,2011(2)：533-540.