，，，

目前缺血性心臟病的治療取得了很大的進(jìn)展，但是心衰作為各種心血管疾病的終末期表現(xiàn)，仍是心血管疾病高病死率和高致殘率的主要原因。曲美他嗪作為一種新型的心肌代謝類藥物，無論動物實驗和臨床試驗均表明其對急、慢性心肌缺血有保護(hù)作用。本研究旨在評價曲美他嗪對心肌梗死后心衰大鼠心功能及心肌超微結(jié)構(gòu)的影響。

1 資料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠50只(體重200 g～250 g)，購自北京維通利華實驗動物有限公司[許可證號：SCXK(京)2012-0001]，由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院倫理委員會監(jiān)督。分籠飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院SPF級動物房，自然光照，飼以標(biāo)準(zhǔn)的大鼠合成飼料，自由飲用純凈水，環(huán)境溫度(25±2)℃，相對濕度(45%～70)%。

1.2 儀器 HP 5500彩色多普勒超聲顯像儀(PHILIPS，America)；HX-200動物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司，中國)；BL-820S 生物機(jī)能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司，中國)；SIM-F124制冰機(jī)(SANYO，Japan)；MLS-3750高壓蒸汽滅菌器(SANYO，Japan)；BA110S千分位電子天平(Sartorius AG，German)；ASP200S脫水機(jī)(Leica，German)；EG1150H包埋機(jī)(Leica，German)；RM2245切片機(jī)(Leica，German)；IX70光學(xué)顯微鏡(OLYPUS，Japan)無菌手術(shù)器械(彎鉗，鑷子，彎鑷，持針器，眼科剪，3×8圓針，6-0線，1號縫合線)和載玻片、PV管。

1.3 藥物與試劑

1.3.1 藥物 曲美他嗪片(遠(yuǎn)大醫(yī)藥有限公司，中國，批號：12070404)；戊巴比妥粉劑(上海艾研生物有限公司，中國，批號：081130251)；注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，中國，批號： H13020657)。

1.3.2 試劑 10%中性甲醛(北京世濟(jì)合力生物科技有限公司，中國，生產(chǎn)日期：2013年6月3日)；伊紅染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，中國，批號：713051)；蘇木素體細(xì)胞染色液(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，中國，批號：130604445H)；蘇木色精返藍(lán)液(北京世濟(jì)合力生物科技有限公司，中國，生產(chǎn)日期：2013年6月3日)；蘇木色精分色液(北京世濟(jì)合力生物科技有限公司，中國，生產(chǎn)日期：2013年6月3日)；Masson三色染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，中國，批號：YZB/粵珠0011-2013)。

1.4 動物模型制備 SD大鼠以2%戊巴比妥液(40 mg/kg體重)進(jìn)行腹腔麻醉[1]，仰臥位固定于大鼠臺上，胸部、頸部手術(shù)視野區(qū)常規(guī)備皮、消毒，同時記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖；頸部手術(shù)視野區(qū)沿氣管方向作長約3 cm左右的縱行切口，逐步分離頸部肌肉，暴露氣管，采用內(nèi)直徑3 mm的氣管導(dǎo)管經(jīng)大鼠口腔插入氣管內(nèi)，以無創(chuàng)縫合線將導(dǎo)管打結(jié)固定于大鼠下顎，氣管一端連接HX-200動物呼吸機(jī)，輔助大鼠呼吸(呼吸機(jī)潮氣量為(9～12) mL，頻率(85～90)次/min，吸呼比為1∶2)；在距胸骨左緣0.5 cm，第3～4肋骨間作長3 cm的縱形切口，從左側(cè)第四肋間鈍性分離皮膚、胸大肌，打開胸腔，用眼科開瞼器拉開第3、4肋，顯示手術(shù)視野，暴露心臟，剪開心包，在肺動脈圓錐與左心耳交界下(1～2) mm處用3×8圓針穿過，用6-0無創(chuàng)性縫線，結(jié)扎冠狀動脈左前降支(LAD)，以穿刺而未結(jié)扎大鼠作為假手術(shù)組；以結(jié)扎部位遠(yuǎn)端心肌變白、搏動減弱且心電圖出現(xiàn)ST段弓背向上明顯抬高為急性心肌梗死(AMI)造模成功標(biāo)志。然后擠出胸腔內(nèi)氣體，縫合外皮，碘伏消毒；術(shù)后連續(xù)3 d注射20萬單位青霉素抗感染。

1.5 分組及給藥 動物購回后在SPF級動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d進(jìn)入實驗；術(shù)前每只大鼠進(jìn)行超聲心動檢測；術(shù)前禁食12 h后，體重均衡，隨機(jī)分為造模組與假手術(shù)組。假手術(shù)組16只和造模組34只；造模組大鼠按本文1.4所述方法造模，術(shù)后大鼠復(fù)蘇24 h后行超聲心動檢測，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)值較手術(shù)前下降大于15%判定為心力衰竭模型復(fù)制成功；造模成功大鼠以隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、曲美他嗪組。

各組大鼠術(shù)后72 h開始灌胃給藥，模型組和假手術(shù)組給予生理鹽水4 ml/kg；曲美他嗪組給予曲美他嗪10 mg/kg溶于生理鹽水灌胃。各組連續(xù)給藥8周，每天1次，于每日09：00-10：00間灌胃給藥，以5 mL注射器連接灌胃針給大鼠灌胃；每周稱量體重1次，根據(jù)體重計算調(diào)整給藥劑量。

1.6 大鼠心功能檢測 大鼠分別于術(shù)前、術(shù)后24 h及藥物干預(yù)后8周行超聲心動檢測。大鼠稱重并以2%戊巴比妥液(40 mg/kg體重)腹腔麻醉，大鼠左胸前廣泛備皮后，仰臥位固定，選取標(biāo)準(zhǔn)左室乳頭肌短軸切面和左室長軸切面結(jié)合M型和多普勒超聲進(jìn)行檢查(CL15-7高頻線陣探頭、7 MHz～15 MHz)，探頭置于其左胸，在取得較理想的胸骨旁左心室短軸二維圖像后，在乳頭肌水平將M型取樣線垂直室間隔和左心室后壁獲得M型超聲心動圖，測定左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)，并計算出LVEF、左室短軸縮短率(FS)和心輸出量(CO)。計算由超聲機(jī)自動完成。所檢測數(shù)據(jù)均測量3次以取其平均值。超聲檢查的操作及分析由不知曉大鼠分組情況的超聲?？漆t(yī)生完成。

1.7 大鼠心肌樣本取材 各組大鼠于給藥第8周，于末次給藥后12 h后采集心肌樣本，每組隨機(jī)采集6例心肌樣本。大鼠麻醉后，迅速打開胸腔，剪開心包，剔除附屬物。心臟經(jīng)生理鹽水溶液反復(fù)沖洗至溶液變清亮，心臟浸入10%中性甲醛溶液室溫固定。

1.8 大鼠心肌樣本制備

1.8.1 大鼠心肌組織HE染色 從10%中性甲醛溶液中取出心臟，修整組織，經(jīng)橫斷切面取出左室中部組織塊，放入包埋盒中，置入脫水機(jī)中脫水，然后常規(guī)石蠟包埋。之后經(jīng)修片、切片、裱片、烤片結(jié)束之后，即可進(jìn)行染色、封片。

1.8.2 大鼠心肌組織Masson染色 充分固定和脫蠟后于玻片心肌組織移入Bouin氏液或Zenker氏液，流水沖洗過夜，常規(guī)脫水包埋；切片脫蠟至水；Weigert鐵蘇木素(Weigert鐵蘇木素A、B液等比例混合液)染(5～10) min，流水稍洗；1%鹽酸酒精分化，流水沖洗數(shù)分鐘；麗春紅酸性品紅染液染(5～30) min，1%冰醋酸沖洗；磷鉬酸溶液處理約5 min后棄掉，不用水洗直接用苯胺藍(lán)染液復(fù)染5 min；1%冰醋酸處理1 min，快速用95%酒精脫水多次；無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。組內(nèi)前后對照采用配對資料t檢驗。各組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較時先進(jìn)行Levene方差齊性檢驗，滿足方差齊性時采用LSD-t檢驗進(jìn)行，不滿足方差齊性采用Dunnetts-t檢驗。假設(shè)檢驗標(biāo)準(zhǔn)以P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 模型復(fù)制及分組 實驗SD大鼠共計50只，隨機(jī)分為假手術(shù)組16只，造模組34只。假手術(shù)組手術(shù)后存活13只，給藥期間無死亡；造模組復(fù)制模型成功28只，以隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)分為模型組14只、曲美他嗪組14只；給藥期間，模型組死亡2只，曲美他嗪組死亡2只。

2.2 曲美他嗪對心梗后心衰大鼠心功能的影響 治療后與模型組比較，曲美他嗪組左室舒張末內(nèi)徑和左室收縮末內(nèi)徑均減低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；LVEF、FS、CO均明顯增加，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

曲美他嗪組治療后與治療前比較，治療后LVIDd與療前無明顯變化；治療后LVIDs較治療前減低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療后LVEF、FS較治療前明顯增加，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；治療后CO較治療前增加，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心功能參數(shù)比較(±s)

2.3 曲美他嗪對心梗后心衰大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 HE染色 假手術(shù)組光鏡下心肌細(xì)胞形態(tài)基本正常，胞質(zhì)、胞核清晰，可見清晰的心內(nèi)膜層、肌層和外膜層。心肌細(xì)胞核呈橢圓形，胞漿內(nèi)肌絲排列整齊，心肌纖維著色均勻(見圖1)。模型組光鏡下心肌梗死灶廣泛分布，梗死灶內(nèi)可見壞死組織及炎性細(xì)胞浸潤，胞漿嗜酸性變，紅染似肌凝狀態(tài)；心肌纖維排列紊亂，部分心肌纖維斷裂，呈灶性壞死，細(xì)胞核消失，可見大量膠原纖維組織，梗死灶內(nèi)有散在島狀分布的存活心肌細(xì)胞，成纖維細(xì)胞稀少，肉芽組織生長稀少(見圖2)。曲美他嗪組光鏡下心肌梗死灶較局限，心肌細(xì)胞部分壞死，心肌纖維排列不整齊，散在心肌纖維斷裂消失，可見梗死灶內(nèi)呈島狀分布的存活心肌細(xì)胞，炎性細(xì)胞浸潤較模型組減少?？梢姵衫w維細(xì)胞和肉芽組織增生較模型組增多(見圖3)。

2.3.2 Masson染色 假手術(shù)組心肌細(xì)胞質(zhì)、肌纖維呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)褐色，膠原纖維呈藍(lán)色?？梢娦募〖?xì)胞排列整齊，正常心肌組織小動脈周圍及心肌細(xì)胞間隙有少許膠原纖維(見圖4)。模型組在梗死灶及周邊，可見壞死心肌細(xì)胞被膠原組織代替?？梢娦募〖?xì)胞肥大、排列紊亂，心肌組織小動脈周圍有較多膠原沉積，并有向心肌細(xì)胞間隙伸展的趨勢。心肌組織間隙的膠原沉積也顯著增加(見圖5)。曲美他嗪組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：可見部分心肌細(xì)胞被膠原纖維代替，膠原纖維與心肌細(xì)胞相間(見圖6)。

圖1 假手術(shù)組心肌組織形態(tài)學(xué)(8周HE×100)

圖2 模型組心肌組織形態(tài)學(xué)(8周HE×100)

圖3 曲美他嗪組心肌組織形態(tài)學(xué)(8周HE×100)

圖4 假手術(shù)組心肌組織形態(tài)學(xué)(8周Masson×100)

圖5 模型組心肌組織形態(tài)學(xué)(8周Masson×100)

圖6 曲美他嗪組心肌組織形態(tài)學(xué)(8周Masson×100)

3 討 論

曲美他嗪作為一種心血管病治療的輔助藥物，由于其特有的優(yōu)化心肌能量代謝的藥理機(jī)制，目前主要用于心肌缺血和心功能不全的輔助治療。正常心肌的能量主要來源于葡萄糖和脂肪酸氧化代謝。脂肪酸氧化代謝產(chǎn)生等量ATP的耗氧量比糖代謝高，因此其產(chǎn)生ATP的效率低于糖代謝。當(dāng)心肌缺血時，冠脈血循環(huán)中的脂肪酸升高，心肌能量代謝以脂肪酸代謝為主，葡萄糖氧化代謝受阻，不但會使耗氧增加，還使糖酵解的產(chǎn)物如乳酸增加。曲美他嗪通過抑制心肌能量代謝中的脂肪酸氧化，使之向葡萄糖氧化轉(zhuǎn)化，提高ATP生成的效率，達(dá)到改善心肌缺血和心功能的作用。

本研究中，與心梗后心衰模型組相比較，曲美他嗪組可以明顯減小心衰后擴(kuò)大的左室收縮末內(nèi)徑和舒張末內(nèi)徑，尤其減小左室收縮末內(nèi)徑，提高左室射血分?jǐn)?shù)和左室短軸縮短率，提高心輸出量，改善心梗后心衰大鼠的心臟收縮功能，這與以往的研究結(jié)果相符[2]。這除了曲美他嗪影響心肌細(xì)胞代謝以外，可能還有其他的機(jī)制參與其中，如①曲美他嗪通過改善缺血細(xì)胞內(nèi)的能量代謝，減少細(xì)胞內(nèi)H+、Na+、Ca2+的超負(fù)荷，抑制氧自由基的生成，提高氧自由基的清除功能，減少細(xì)胞膜的脂質(zhì)氧化，而具有強(qiáng)大的抗氧化作用[3]。②在缺氧狀態(tài)下，線粒體內(nèi)Ca2+超負(fù)荷可以引起線粒體腫脹，氧化磷酸化障礙，曲美他嗪可以與膜上的可通透性蛋白結(jié)合并使之失活以抑制Ca2+引起的線粒體腫脹，從而減少凋亡蛋白細(xì)胞色素C釋放，抑制下游的caspase酶，阻止細(xì)胞凋亡[4-5]。

心功能的改善依賴于心肌細(xì)胞的存活。本研究中，模型組心肌梗死灶內(nèi)可見壞死組織及炎性細(xì)胞浸潤；心肌纖維排列紊亂，部分心肌纖維斷裂，呈灶性壞死，細(xì)胞核消失，梗死灶內(nèi)有散在島狀分布的存活心肌細(xì)胞，肉芽組織生長稀少。在梗死灶及周邊，可見壞死心肌細(xì)胞被膠原組織代替。曲美他嗪組心肌梗死灶較局限，心肌細(xì)胞部分壞死，散在心肌纖維斷裂消失，可見梗死灶內(nèi)呈島狀分布的存活心肌細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和肉芽組織增生較模型組增多，部分心肌細(xì)胞被膠原纖維代替，膠原纖維與心肌細(xì)胞相間。提示曲美他嗪可能有抑制心梗后心肌細(xì)胞凋亡、改善心肌纖維化的作用。這與之前的研究結(jié)果相一致[6-7]。

曲美他嗪作為一種優(yōu)化心肌代謝的藥物，在不影響心率、血壓的情況下，通過優(yōu)化心肌的能量代謝而改善心室的收縮功能、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)而阻止心肌細(xì)胞凋亡，對心梗后心衰大鼠的心功能和心肌超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生有益的影響。其臨床療效也逐漸得到證實，在心絞痛、心力衰竭、心肌再灌注損傷等方面都有一定的治療作用。

[1] Pfeffer MA，Braunwald E.Ventricular remodelling after myocardial infarction：experimental observations and clinical implications[J].Circulation，1990，81：1161-1172.

[2] 李兵，陳相健，朱舒舒，等.曲美他嗪對慢性心力衰竭大鼠心肌能量代謝及超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中華老年心腦血管病雜志，2008，10(6)：447-450.

[3] 張銳，韋建瑞，尹海燕，等.曲美他嗪對休克患者腎功能影響的臨床研究[J].中華危重癥急救醫(yī)學(xué)，2014，26(1)：219-222.

[4] Gong X，F(xiàn)an G，Wang W，et.al.Trimetazidine protects umbilical cord mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation induced apoptosis by activation of akt[J].Cell Physiol Biochem，2014，34：2245-2255.

[5] Singh D，Chopra K，RETRACTED：Effect of trimetazidine on renal ischemia /reperfusion injury in rats[J].Pharmacological Research，2004，50：623-629.

[6] Xu H，Zhu G，Tian Y.Protective effects of trimetazidine on bone marrow mesenchymal stem cells viability in an ex vivo model of hypoxia and in vivo model of locally myocardial ischemia[J].J Huazhong Univ Sci Technology Med Sci，2012，32：36-41.

[7] 馮翔宇，李彤，李秀華，等.曲美他嗪與雷米普利對心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的影響[J].中華老年心腦血管病雜志，2014，16：856-859.