孫暢 綜述，路順，郎錦義審校

646000四川 瀘州，西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤科(孫暢);610041成都，四川省腫瘤醫(yī)院·研究所，四川省癌癥防治中心，電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院 放療科(路順、郎錦義)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是指起源于鼻咽腔的惡性腫瘤，高發(fā)于東亞、東南亞、南亞中部、北非和東非等地，也是我國的高發(fā)惡性腫瘤之一[1]。其發(fā)病機(jī)制由多種因素構(gòu)成，主要包括：遺傳易感性、EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染、飲食與環(huán)境因素等[2]。其中，EBV感染是NPC病因中研究最為廣泛與深入的病因之一。這也反映出NPC的發(fā)生發(fā)展與EBV的感染有著密切的關(guān)系，并且有望通過對(duì)EBV的進(jìn)一步研究而影響NPC的診治[2]。

1 EBV

1.1 EBV的感染相關(guān)抗原

EBV是人類發(fā)現(xiàn)的第一種腫瘤相關(guān)線性雙鏈DNA病毒[3]，其感染具有分布廣、可流行、多散發(fā)等特點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年有超過20萬的癌癥患者與EBV感染相關(guān)[4]。在所有因癌癥死亡的患者中，有1.8%與EBV感染引起的惡性腫瘤有關(guān)[5]。EBV可感染B淋巴細(xì)胞及上皮細(xì)胞，在感染免疫功能正常的個(gè)體后通常會(huì)進(jìn)入休眠狀態(tài)。盡管如此，該病毒仍能夠持續(xù)在人體內(nèi)限制性地通過EBV編碼的小RNA和病毒microRNA來表達(dá)病毒產(chǎn)物。而在免疫功能低下的宿主體內(nèi)，EBV于淋巴組織中大量增殖，并可異位感染T細(xì)胞與NK細(xì)胞等，導(dǎo)致宿主免疫系統(tǒng)功能紊亂[6]。EBV感染人體可分為增殖感染與潛伏感染，因而EBV的抗原也分為增殖感染相關(guān)抗原和潛伏感染相關(guān)抗原。增殖感染相關(guān)抗原主要包括：(1)EBV早期抗原(early antigen,EA)；(2)EBV殼抗原(viral capsule antigen,VCA)；(3)EBV膜抗原(membrane antigen,MA)。其中，EA的出現(xiàn)是EBV活躍增殖的標(biāo)志，而VCA和MA則屬于EBV的結(jié)構(gòu)抗原[7]。EBV潛伏感染時(shí)表達(dá)的抗原主要分為EBV核抗原(Epstein-Barr virus nuclear antigen，EBNA),包括EBNA1、EBNA2、EBNA3 和主導(dǎo)蛋白(leader protein,LP)等6種核抗原。其中EBNA1被認(rèn)為是唯一在所有與EBV相關(guān)的腫瘤中都表達(dá)的病毒編碼抗原，是細(xì)胞轉(zhuǎn)化必需的抗原；一些EBNA1的特定變種可以改變宿主重要的調(diào)控作用，從而打破病毒的潛伏感染，促成EBV相關(guān)癌變的發(fā)生[8]。EBNA2常被認(rèn)為是B 淋巴細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的必需蛋白，可反式調(diào)節(jié)潛伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)，并且能刺激細(xì)胞表達(dá)CD21 和CD23。EBNA3 包括EBNA 3A、3B 和3C。其中，EBNA 3A與3C是體外B細(xì)胞轉(zhuǎn)化的必要基因。LP可通過與EBNA2 酸性反式激活結(jié)構(gòu)域的相互作用，很大程度上增加EBNA2 反式激活LMP1 表達(dá)的作用，并且LP也為淋巴母細(xì)胞系生長所需[3]。

1.2 EBV病毒標(biāo)志物與NPC的關(guān)系

作為致癌的人類病毒之一，EBV與胃癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤等腫瘤關(guān)系密切[9]，不同EBV株的生物學(xué)特性也指向了不同類型的癌癥[10]。尤其是在未分化的NPC中，90%以上的患者呈EBV陽性[11]。NPC細(xì)胞在EBV潛伏感染后既可表達(dá)編碼蛋白基因，例如LMP1、LMP2A與LMP2B等，也能表達(dá)非編碼蛋白基因，包括EBV編碼的小RNAs(EBV-encoded small RNA,EBER)及微小RNA(mini-RNAs,miRNAs)中BamH1 A向右轉(zhuǎn)錄[3]。一旦感染EBV，部分病毒基因便可為腫瘤細(xì)胞提供有利的生長和生存條件，最終導(dǎo)致NPC的發(fā)生或發(fā)展。有體外研究表明，細(xì)胞周期蛋白D1過度表達(dá)有利于維持EBV感染的鼻咽上皮細(xì)胞永生化[12]。在EBV陰性的低級(jí)別不典型增生病變和正常鼻咽上皮細(xì)胞的基因中，3p、9p的缺失已被證實(shí)會(huì)提高患NPC的風(fēng)險(xiǎn)[3]。EBV感染后出現(xiàn)的基因改變(例如：雜合性丟失的染色體11q、16q、13q與14q)和表觀遺傳的變異可促使惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移[13-14]， Huang等[15]的研究也證實(shí)，NPC發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)制與EBV慢性感染引發(fā)的巨噬細(xì)胞募集和活化相關(guān)。

2 EBV在NPC診治中的角色

2.1 EBV在NPC診斷分期與篩查的意義

由于NPC的臨床癥狀無明顯特異性，患者前往醫(yī)院行相關(guān)檢查時(shí)往往已為晚期。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，我國NPC患者放化療后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的5年疾病特異生存率分別為100.0%、96.4%、82.7%和70.4%[16-17]。由此可見，提高NPC的早期篩查與診斷率將很大程度上影響其治療效果及預(yù)后。

已有學(xué)者提出，可利用EBV特異性抗體和EBV DNA來診斷早期NPC，且EBV感染后的特異性病理學(xué)改變有助于NPC病理學(xué)診斷[18]。隨著檢測(cè)技術(shù)革新以及對(duì)EBV的研究更為深入，目前研究者傾向于聯(lián)合多種EBV抗體與EBV DNA來進(jìn)行檢測(cè)[19]，以提高NPC篩查與早期診斷的特異性與敏感性。我國的人口基數(shù)及人群的遺傳易感性為NPC的早期篩查提供了有利條件，大樣本的聯(lián)合檢驗(yàn)有利于指導(dǎo)研究者篩選出最為敏感與特異性的EBV相關(guān)指標(biāo)，從而提高早期NPC的發(fā)現(xiàn)率。

盧煜明教授及其研究團(tuán)隊(duì)發(fā)布的最新一項(xiàng)研究[20]顯示，在20 174名參與實(shí)驗(yàn)的香港男性血清樣本中，有1 112人的樣本里帶有EBV DNA(5.5%)。研究人員隨后進(jìn)行了為期4周的二次測(cè)試，發(fā)現(xiàn)其中309人持續(xù)存在EBV DNA，實(shí)驗(yàn)者針對(duì)這些兩次檢驗(yàn)都是陽性的部分受試者予以了鼻腔鏡和MRI的檢查，結(jié)果顯示其中有34人確診NPC(11.0%)。此實(shí)驗(yàn)中EBV DNA篩查的敏感性和特異性分別為97.1%和98.6%。值得注意的是，在這34名確診NPC的患者中，有24名患者臨床分期為I、II期;與同期香港確診的NPC相比，I、II期患者的比例要高出許多(70.6% vs 19.3%)。后續(xù)的研究也體現(xiàn)出，由于這些患者初診時(shí)癌癥處于早期，經(jīng)治療后他們的3年無進(jìn)展生存率要顯著高于歷史數(shù)據(jù)(97% vs 70%)。內(nèi)地也有學(xué)者進(jìn)行了不同的實(shí)驗(yàn)，張曉琍等[21]通過對(duì)比健康體檢者8 884名、有鼻咽局部癥狀就診者1 546例與確診NPC的患者155例中血清EBV抗體水平得出：血清中Rta-IgG、VCA-IgA、EA-IgA抗體的指標(biāo)對(duì)NPC均具有一定臨床診斷價(jià)值，這3項(xiàng)指標(biāo)的聯(lián)合檢測(cè)，可將NPC診斷的敏感性提高至94.1%，特異性提高至98.9%。俞霞等[22]對(duì)比152例初治NPC患者與657例健康體檢者血清中EBNA1/IgA、Zta-IgA、VCA-IgA和EBV DNA水平后，得出結(jié)論為：對(duì)于無癥狀人群，首選EBNA1/IgA指標(biāo)來篩查NPC，靈敏度為77.8%；推薦采用血清EBV DNA來輔助診斷晚期NPC患者，靈敏度可達(dá)88.8%；聯(lián)合檢測(cè)前兩項(xiàng)指標(biāo)的靈敏度為92.1%，特異度為96.9%，并可提高對(duì)NPC的診斷效率，Zta/IgA可間接反映淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，并有望對(duì)患者病情評(píng)估起到作用。趙新星等[23]檢測(cè)228名NPC患者與健康人群的對(duì)照，得出EBV-Rta/IgG可作為早期篩查NPC的臨床指標(biāo)之一。邱厚匡等[24]收集272例NPC患者，采用Rta-IgG、VCA-IgA、EA-IgA與EBV DNA聯(lián)合檢測(cè)后，得出4項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)時(shí)敏感度最高達(dá)99.63%，可用于早期NPC患者的篩查，任意2項(xiàng)或2項(xiàng)以上指標(biāo)呈陽性時(shí)應(yīng)高度懷疑NPC，其特異性在93.0%以上。葉倩等[25]聯(lián)合4項(xiàng)EBV指標(biāo)(即Rta-IgG、VCA-IgA、EA-IgA與EBV DNA)檢測(cè)的研究也得出了相似的結(jié)論。另有He等人[26]在研究血漿中非編碼長RNA的生物標(biāo)志物后指出：MALAT1、AFAP1-AS1與AL359062這三個(gè)lncRNA指標(biāo)的水平與EBV感染相關(guān)，且對(duì)NPC的療效評(píng)估及預(yù)后判斷具有參考價(jià)值。

2.2 EBV與NPC治療

目前標(biāo)準(zhǔn)的NPC治療模式是以放射治療聯(lián)合化療為主的綜合治療，但因鼻咽腔的解剖特點(diǎn)及NPC的生物學(xué)特性，常規(guī)的局部放射治療常常會(huì)累及到周圍重要的器官組織，從而引起一系列副反應(yīng)及后遺癥[27]。而今新興的治療手段，如免疫及靶向治療等越來越多地受到研究者關(guān)注[28-31]。EBV可以在感染細(xì)胞的質(zhì)膜中誘導(dǎo)多種免疫原性肽的表達(dá)，這些EBV相關(guān)抗原便可作為抗腫瘤免疫治療的靶點(diǎn)[32]。同時(shí)，EBV在NPC細(xì)胞中的持續(xù)存在，提示可以利用免疫系統(tǒng)的T細(xì)胞識(shí)別病毒抗原所表達(dá)的部位(EBNA1，LMP1、LMP2等)來靶向定位EBV相關(guān)NPC細(xì)胞[32]。另外，EBV感染可能會(huì)影響NPC靶向治療的效果。例如，EBV相關(guān)的LMP1可介導(dǎo)NPC細(xì)胞中表皮生長因子受體(epidermal growth - factor receptor,EGFR)的表達(dá)，使NPC細(xì)胞對(duì)抗EGFR的靶向治療更敏感[33]。有研究者通過重新構(gòu)建一種EBV相關(guān)EBNA1特異性miRNA表達(dá)系統(tǒng)，來探究miRNA與NPC的關(guān)系，并證實(shí)miRNA中miR-31-5p的靶向表達(dá)可以作為新型NPC靶向治療的切入點(diǎn)[34]。而在探究NPC放療增敏的過程中，Gao等[35]通過研究EBV編碼的微小RNA BamH1 A向右轉(zhuǎn)錄7(EBV-encoded microRNA BART7,ebv-miR-BART7)后指出：ebv-miR-BART7可抑制GFPT1和TGFβ1的表達(dá)從而降低NPC細(xì)胞的放射敏感性；檢測(cè)NPC細(xì)胞中的ebv-miR-BART7基因，可能有助于預(yù)測(cè)NPC患者的預(yù)后及治療效果。

2.2.1 EBV相關(guān)的疫苗 利用疫苗對(duì)EBV感染的潛在NPC患者進(jìn)行預(yù)防與治療，是目前研究的熱點(diǎn)[36-37],主要包括預(yù)防性疫苗與治療性疫苗。前者主要以病毒包膜糖蛋白gp350為靶點(diǎn)，依靠接種后體液免疫產(chǎn)生的中和性抗體阻斷EBV感染路徑來實(shí)現(xiàn)預(yù)防目的[38]。而LMP2的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)和樹突狀細(xì)胞疫苗則是針對(duì)NPC患者的治療性疫苗，可以通過識(shí)別LMP2抗原表位來發(fā)揮定向殺傷和清除EBV感染NPC細(xì)胞的作用[28,39]。NPC細(xì)胞能較穩(wěn)定地表達(dá)LMP2A，因而LMP2A被認(rèn)為是NPC免疫治療的理想靶標(biāo)。趙瑋等[40]通過構(gòu)建EBV相關(guān)LMP2A的減毒單核增生性李斯特菌重組疫苗(recombinant attenuated Listeria monocytogenes vaccine-LMP2A,Lmdd-LMP2A)并檢測(cè)其在NPC瘤鼠身上的抑瘤效應(yīng)后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，Lmdd-LMP2A能抑制腫瘤生長，并且安全性較好，還能誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。Smith等[41]利用新抗原拼接疫苗(adenovirus scrambled antigen vaccine,Ad-SAVINE)對(duì)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的NPC患者進(jìn)行了臨床實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)約2/3的實(shí)驗(yàn)組患者EBV的CTL水平明顯升高，并且接受這種免疫疫苗治療的患者中位總生存期由220天升至523天，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)，使用Ad-SAVINE免疫疫苗治療的安全性與耐受性好，能使NPC患者生存獲益。英國研究者[37]開發(fā)了一種治療性新疫苗MVA-EL(modified vaccinia Ankara-EBNA1 and LMP2,MVA-EL)，這種疫苗與EBV標(biāo)志物中EBNA-1及LMP2的編碼有著密切的聯(lián)系。實(shí)驗(yàn)人員用MVA-EL治療了16例EBV陽性的NPC患者，結(jié)果證實(shí)此疫苗在多數(shù)實(shí)驗(yàn)者中耐受性良好且安全，其中8/14例的接種者至少增加了1種抗原,且研究者發(fā)現(xiàn)該疫苗可提高實(shí)驗(yàn)中不同人種的人類白細(xì)胞抗原A*02.01限制性LMP2相關(guān)特異性T細(xì)胞反應(yīng)的頻率。因此認(rèn)為其安全性和免疫原性適用于全球不同的EBV陽性腫瘤。

2.2.2 NPC的過繼免疫治療 多項(xiàng)研究報(bào)道，過繼性細(xì)胞治療可以控制EBV相關(guān)NPC患者的疾病進(jìn)展[42- 44]。在一項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，Chia等[45]分析復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的38例EBV陽性NPC患者后發(fā)現(xiàn)，在4個(gè)周期的吉西他濱+卡鉑的化療后加入6次EBV特異性的CTL過繼性免疫治療，所有患者對(duì)免疫治療耐受性良好，免疫治療過程中未出現(xiàn)嚴(yán)重的血液和非血液系統(tǒng)毒副反應(yīng)。相較于使用傳統(tǒng)治療晚期NPC的方案，患者有著更好的生存獲益，隨訪后中位生存期為29.9個(gè)月，2年和3年總生存率(overall survival, OS)分別為62.9%和37.1%。研究者提出，對(duì)于進(jìn)展期NPC，化療聯(lián)合過繼性免疫治療可能成為一種有前景的治療模式。Secondino等[46]指出，針對(duì)常規(guī)治療失敗的EBV陽性NPC患者，在接受化療后給予高劑量的EBV特異性CTL輸注有較好的臨床獲益，且患者治療的耐受性及不良反應(yīng)相對(duì)較理想。但也有學(xué)者指出[47]，對(duì)復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移的NPC患者給予EBV-CTL治療總體療效并不理想。對(duì)于常規(guī)治療難以控制的NPC，如何提高EBV相關(guān)免疫治療的效果仍需進(jìn)一步研究。

此外，EBV可以誘導(dǎo)感染細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)發(fā)生改變，如DNA甲基化和組蛋白的去乙?；?，因此EBV引起的遺傳學(xué)改變被認(rèn)為是新興療法的潛在目標(biāo)[48]。針對(duì)EBV相關(guān)NPC抗EGFR藥物的II期和III期臨床試驗(yàn)也正在進(jìn)行中[32]。

2.3 EBV與NPC患者的預(yù)后

已有研究證實(shí)，對(duì)EBV DNA滴度的定量檢測(cè)可用于監(jiān)測(cè)NPC局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，作為NPC傳統(tǒng)影像學(xué)隨訪的補(bǔ)充手段[49-50]。血漿EBV DNA的高滴度與EBER-RNA的表達(dá)被認(rèn)為與NPC的預(yù)后不良和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散相關(guān)[51-52]。令狐穎等[53]將130例EBV Zta-IgA與VCA-IgA抗體陽性患者按照抗體滴度分為低、中和高3組，隨訪后得出Zta-IgA及VCA-IgA抗體的3個(gè)滴度組患者平均生存時(shí)間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Zta-IgA組高-中-低滴度的平均生存時(shí)間分別約為23.78、27.39、31.11個(gè)月，VCA-IgA組則約為23.62、26.96、31.54個(gè)月，且Zta-IgA與VCA-IgA抗體水平與NPC患者的總生存期相關(guān)，是決定NPC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Liu等[54]確定了5種與NPC患者無病生存期(disease-free survival, DFS)關(guān)聯(lián)的EBV相關(guān)miRNA，并通過數(shù)學(xué)建模的方式計(jì)算出每名病人5種miRNAs表達(dá)值的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，得出與低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者相比，高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的患者有較短的DFS、OS與疾病無轉(zhuǎn)移生存率，結(jié)合對(duì)miRNA標(biāo)志物的識(shí)別與TNM分期較單獨(dú)使用TNM分期來提示臨床預(yù)后更具價(jià)值，并可能指導(dǎo)高進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的NPC患者的治療策略。連仕鋒等[55]同時(shí)測(cè)定EBV相關(guān)VCA及EBNAl的IgA抗體，并對(duì)結(jié)果對(duì)應(yīng)的不同人群擬定不同的NPC患病風(fēng)險(xiǎn)水平，此后定期檢測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)人群的IgA抗體變化。結(jié)果提示，此方法能提高NPC的篩查率和早期確診率。另有學(xué)者對(duì)比檢測(cè)接受過治療的NPC患者的EBV游離DNA(cell-free DNA, cfDNA)與循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTCs)后發(fā)現(xiàn)，在反映NPC患者的療效上，檢測(cè)EBV cfDNA優(yōu)于CTCs[56]。但并非所有實(shí)驗(yàn)都得出了陽性的結(jié)論，Zhou等[57]在研究NPC中程序性死亡受體-配體1(programmed death-ligand 1, PD-L1)與程序性死亡受體1的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)PD-L1是NPC不良預(yù)后的指標(biāo)，并且與EBV DNA的載量無關(guān)。因此，總結(jié)并分析目前檢測(cè)EBV DNA的不同方法，并最終得出有效且可行的檢測(cè)方式，是現(xiàn)今學(xué)者們研究的又一新方向[58]。

3 前景展望

隨著全基因測(cè)序及新液體活檢技術(shù)的應(yīng)用，會(huì)使更多EBV陽性的NPC基因靶點(diǎn)與相關(guān)標(biāo)志物被研究出來，同時(shí)也將影響NPC的診治[3]。如何提高EBV相關(guān)免疫靶向治療的安全性與耐受性，還需多中心大樣本的臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估和確認(rèn)。為了更好地診斷和治療EBV相關(guān)腫瘤，還應(yīng)該實(shí)現(xiàn)EBV DNA的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)并找出EBV感染靶細(xì)胞的類型。更多深入的研究也應(yīng)從EBV的角度出發(fā)，探尋NPC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及免疫逃逸等方面的機(jī)制。此外，如何聯(lián)合目前已有的放化療手段與EBV免疫治療手段，從而建立新的綜合治療方案，將會(huì)成為新時(shí)代免疫治療發(fā)展的趨勢(shì)。未來可以期待是，更高敏感性與特異性的EBV抗體標(biāo)志物的聯(lián)合篩查，將給NPC高危人群的預(yù)防、診斷及隨訪帶來更多的福音。研究者對(duì)EBV與NPC的關(guān)系不懈探索，對(duì)今后NPC的診治起到積極的指導(dǎo)作用，也從另一方面反映了腫瘤病毒學(xué)對(duì)整個(gè)癌癥領(lǐng)域的深遠(yuǎn)影響。今后更多的研究與發(fā)現(xiàn)也將引導(dǎo)我們使用EBV這把老鑰匙，打開診治NPC的新大門。

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